전자현미경
[ electron microscope ]
전자현미경(electron microscope)은 과학자들이 고해상도를 이용하여 미생물(microorganism)의 미세구조를 이해할 수 있도록 개발되었다. 인간이 육안으로 볼 수 있는 해상도(resolution)는 0.2 ㎜이지만 광학현미경(optical microscope)으로 관찰할 수 있는 해상도는 0.2 ㎛이다. 전자현미경은 광학현미경과는 달리 영상을 만들어내기 위하여 전자빔을 (electron beam)사용한다. 이 전자빔은 전자석 렌즈로 초점을 맞춘다. 빛 대신에 전자의 사용은 해상도를 약 0.1 ㎚, 광학현미경보다 약 1,000배 향상시킨다. 향상된 해상도는 생물학자들에게 시료의 미세구조를 관찰하기 쉽도록 해준다. 생물학자들은 생물체의 슬라이스를 연구하기 위하여 투과전자현미경(TEM)을 사용하는데, 이들 슬라이스는 세포의 내부 구조를 보여준다. 생물학자들은 시료의 표면을 연구하기 위하여 주사전자현미경(SEM)을 사용한다. SEM은 시료의 전체표면에 전자빔을 조사한 후 스캔하여 표면의 3차원 영상을 생성한다.
목차
기원
전자현미경의 기원은 1929년 독일의 Ernst Ruska가 음극판을 연구하는 과정에서 직경 0.3 ㎜인 양극 조리개의 영상을 확대시킨 실험에서 시작되었다. 그 후 1931년에 Max Knoll과 Ernst Ruska는 전자빔을 사용하는 투과전자현미경을 제작하였다. Ruska 박사는 전자현미경의 발전에 커다란 공헌을 하였으며, 그 공로를 인정받아서 1986년에 노벨물리학상을 수상하였다. 1938년 독일의 Siemens 회사는 최초의 전자현미경을 상용화하였으며, 그 후 40년대에 미국(RCA), 일본(Hitachi), 네덜란드(Philips)에서 각각 상용화된 제품을 생산판매하면서 전자현미경은 널리 보급되었다.
종류와 기본 원리
전자현미경(electron microscope)은 세포나 세포 구조물을 관찰하기 위해 가시광선 대신에 전자를 사용한다. 전자현미경에서는 전자석이 렌즈의 기능을 하며, 전체 시스템은 진공에서 작동한다. 전자현미경은 전자영상(electron micrograph)이라 불리는 사진을 촬영하기 위해 사진기가 장착되어 있다. 투과전자현미경과 주사전자현미경의 두 가지 종류의 전자현미경이 일반적으로 사용된다.
투과전자현미경투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)은 세포와 세포 구조를 매우 높은 배율과 해상력으로 관찰하는데 이용된다. TEM의 해상력은 광학현미경의 해상력보다 훨씬 커서 분자 수준도 관찰이 가능한데, 그 이유는 전자의 파장이 가시광선의 파장보다 훨씬 더 짧고, 파장이 해상력에 영향을 미치기 때문이다. 예를 들어, 광학현미경의 해상력은 약 0.2 ㎛ (10⁻⁹ m)이며, TEM의 해상력은 1,000배 정도 향상된 약 0.2 ㎚이다. 이러한 높은 해상도로 단백질이나 핵산 등의 개별 분자도 전자현미경에서는 관찰이 가능하다. 그러나 가시광선과 달리 전자는 투과성이 약하여 한 개의 세포조차도 전자가 투과하기에 너무 두껍다. 이에 따라 세포의 내부구조를 관찰하기 어렵기 때문에 세포의 얇은 박절편(thin sections)이 필요하고, 안정화 되어야하며, 영상화를 위하여 다양한 화학물질에 의해 처리되어야한다. 예를 들어, 한 개의 세균(bacterium) 세포는 아주 얇은 박편(20~60 nm)으로 잘라 TEM으로 관찰한다. 충분한 대비차를 얻기 위해, 시료를 오스믹산(osmic acid), 또는 과망간산(permanganate), 우라늄(uranium), 란타니움(lanthanium)이나 납의 염(lead salt) 등의 염료로 처리한다. 이러한 물질은 원자량이 큰 원자들로 구성되어 있어, 전자를 산란시키는 능력이 뛰어나 대비를 향상시킨다. 단순히 생물체의 외부구조를 관찰할 경우에는 얇은 박절편은 필요하지 않다. 음성염색법(negative staining)을 이용하여 TEM으로 온전한 세포 또는 세포내 소기관들을 직접 관찰할 수도 있다.
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투과전자현미경 (Morgagni 268D) (출처: )
![]() (A) Aquaspirillum magnetotacticum의 투과전자현미경사진. (배율 x123,000) (출처: gettyimagesEDGE RM 145094114) |
![]() (B) Prevotella melaninogenica의 투과전자현미경 사진 (배율 x78,000) (출처: gettyimagesEDGE RM vis901039) |
주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)은 세포의 3차원 영상을 관찰하기 위하여 사용한다. 주사전자현미경을 사용하기 위해서는 시료를 금과 같은 중금속의 얇은 막으로 코팅한다. 그 후, 전자빔이 시료를 전체적으로 스캔한다. 금속 코팅에서 산란된 전자를 모아 영상을 만들어 내기 위해 수상기 화면에 투사한다. SEM을 사용할 경우에는 상대적으로 큰 시료도 관찰할 수 있다. SEM은 최소 15배부터 10만배의 넓은 범위의 배율을 가지고 있을 수 있으나, 보통 물체의 표면만 영상화가 가능하다. TEM 또는 SEM의 전자현미경 영상은 본래 흑백 영상이다. 이 영상도 얻을 수 있는 최대한의 과학적인 정보를 가지고 있지만, 보통 컴퓨터로 조작하여 전자현미경 영상을 컬러화 한다. 그러나 이러한 인위적 컬러는 현미경 영상의 해상력을 향상시키지는 않는다. 단지 대중 매체를 통한 일반의 관심을 끌기 위한 영상의 예술적인 가치를 높이는 데 기본적인 목적이 있다.
![](https://img-api.cboard.net/img_n.php?image_url=https://dbscthumb-phinf.pstatic.net/5282_000_1/20181218204404345_COCN8MIE0.jpg/GettyImages-5163.jpg?type=w540_fst_n)
주사전자현미경 (출처: gettyimagesEDGE RF 516392245)
![]() 세균 Staphylococcus epidermidis 주사전자현미경 사진. (배율x12,330) (출처: gettyimagesEDGE RM 128617310) |
![]() Bacillus thuringiensis 주사전자현미경 사진. (배율 x 10,000)(출처: gettyimagesEDGE RM 128542330) |
구성
전자현미경은 광학현미경과 장치와 기능에서 광학현미경과 유사하지만, 3가지 주요 시스템으로 나눌 수 있다.
(1) 조사시스템(illumination system): 광선을 생성하여 시스템을 통해 통과하도록 한다:
① 전자발생기(source): 시료 영상을 형성하는데 사용되는 전자총(electron gun)에서 전자를 방출한다.
② 콘덴서 렌즈(condenser lens): 시료에서 조명의 강도를 조절한다.
(2) 영상시스템(imaging system) – 이 시스템은 시료의 확대 영상을 생성하는 렌즈를 포함한다.
① 대물렌즈(objective lens) – 이 렌즈는 중간크기로 확대된 영상을 형성한다.
② 프로젝션 렌즈(projection lens) – 최종 영상을 형성하기 위하여 대물렌즈의 영상을 확대한다.
(3) 영상기록(imaging recording) 및 관찰시스템(viewing system) – 이 시스템은 방사선을 볼 수 있는 정식 영상으로 전환시킨다.
① 관찰스크린(viewing screen): 시료를 관찰할 수 있도록 한다.
② 사진판(photographic plates): 영상을 오랜 기간 동안 기록한다.
시료 준비
투과주사전자현미경(TEM)을 사용한 생물시료의 관찰을 위해서는 시료가 평면이고 60~100 ㎚의 박절편(thin sections)을 만들어야 하지만, 주사전자현미경을 사용한 생물시료의 관찰은 표면과 내면을 입체적으로 보는 것으로 시료제작 방법이 다르다. TEM 시료의 제작방법은 광학현미경에서의 제작방법과 기본적으로 동일하다. 조직의 세절, 고정, 탈수, 침투, 포매, 다듬기, 박절, 염색 및 관찰에 이르기까지의 순서에 따른 차이는 없다. 다른 점은 광학현미경에서의 절편은 두께가 4 ㎛ 정도인데 비하여, 전자현미경에서의 절편은 60~100 ㎚의 박절편을 필요로 하는 점과 전자현미경의 해상력이 ㎚ 단위라는 것이다. 여기에서는 투과전자현미경에서의 시료준비에 대하여 간단히 알아보도록 한다.
- 대상 채취 및 세절: 시료의 채취는 시료가 건조되지 않게 시료 위에 고정액을 떨어뜨리고 실제현미경으로 대상 부분을 관찰하면서 양면날로 적절한 크기로 잘라서 시료 병에 넣어 준비한다.
- 고정(fixation): 대상 세포(조직)는 자가융해 방지, 세포 성분의 단백질 응고와 침전, 조직의 경화 등을 통해서 생체 상태에 가깝게 유지시키기 위하여 고정한다. 고정제의 종류에는 여러 가지가 있으나 보통 실험실에서 많이 사용하고 있는 글루타르알데히드나 파라포름알데히드와 같은 알데하이드류와 금속염 고정액인 오스뮴 등이 대표적이다.
- 탈수(dehydration): 탈수는 조직 내에 들어있는 수분을 완전히 제거하여 치환제와 포매제가 잘 침투되도록 하기 위하여 실시한다. 탈수제로는 유기용매인 에탄올과 아세톤을 주로 사용한다. 불충분한 탈수나 과탈수는 시료를 초박절(thin sectioning)하는데 어려움을 초래할 수 있으며, 처리과정에서 인공산물이 생길 수 있으므로 주의해야 한다.
- 침투(infiltration) 및 포매(embedding): 일련의 과정이 끝나게 되면, 시료는 균일한 두께의 초박절편을 얻기 위하여 포매 과정을 거친다. 침투 및 포매제의 조건으로는 매우 얇은 초박절편을 만들어야 하기 때문에 초박절이 쉬워야 하고 중합한 수지가 전자선에 잘 견디어야 하며, 3차원 구조에서 변화가 없어야 한다. 포매는 조직 내의 탈수 용매를 포매제와 대체시켜주는 침투과정을 거치고, 조직 내의 모든 틈새를 포매제로 채워 넣는 과정이다. 고정 및 탈수가 끝난 조직에 포매제를 완전하고 균일하게 침투시켜야 후에 초박절편(thin section)제작이 용이하게 된다. 전자현미경용의 포매제가 많이 개발되어 왔는데, 불수용성 포매제로서 폴리에스터레진(polyester resin)과 현재 가장 널리 사용되는 우수한 포매제로서 염색성 우수하고, 전자선에도 잘 견디는 에폭시레진(epoxy resin)이 있으며, 수용성 포매제로는 두르쿠판(durcupan), 글리콜메타크릴산(glycol methacrylate), 젤라틴(gelatin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등이 알려져 있다.
- 박절(thin sectioning): 포매가 끝난 전자현미경용 생물시료는 전자빔의 투과한계가 있기 때문에 시료를 가능하면 얇게 초박절해야 할 필요가 있다. 전자현미경에서는 광학현미경에서의 절편보다 1/100 정도 얇은 초박절편을 만든다. 초박절편을 얻기 위해서는 초미세박편기(ultramicrotome)를 사용한다. 이때 사용하는 칼에는 주로 유리칼 또는 다이아몬드칼이 사용된다.
- 염색(staining): 세포 또는 조직의 미세구조는 전자밀도가 낮아서 관찰하기가 어렵다. 이를 개선하는 방법으로 시료에 중금속을 붙여서 초박절편에 전자밀도를 높이는 방법을 선택한다. 이 방법을 전자염색(electron staining)이라고 하는데 염색약으로는 아세트산우라닐(uranyl acetate)과 구연산납(lead citrate)을 사용한다.
- 관찰: 고진공상태에서 고전압에 의해 생겨나오는 전자빔이 시료를 투과하여 형광판위에 나타나는 영상을 관찰하며, 평면적인 세포소기관의 초기미세구조도 잘 관찰할 수 있다.
수차현상
전자현미경에서 수차현상(aberrations)은 전자현미경이 보여주는 확대의 범위에 따라 3차 오류(third-order errors), 5차 오류(fifth-order errors) 등으로 불린다. 3차 수차현상(third-order aberration)은 높은 차원의 수차현상보다 더 부담이 되기 때문에 전자현미경에서 중요하며 다음과 같이 구분된다.
- 구형수차(spherical aberration): 개구부 결함(aperture defect)이라고도 불리는 구형수차는 언급한 결함가운데 가장 중요한데 전자현미경의 해상력의 한계 때문에 발생한다. 이 수차는 3차 오류로서 최초 초점(전자현미경 대물렌즈)에 인접한 축방향 지점의 영상에 나타난다.
- 뒤틀림(distortion): 뒤틀림이 생기면 영상은 뒤틀린 맥주통 모양으로 나타난다. 뒤틀림은 흔히 프로젝트 렌즈로 사용되는 전자석 렌즈에서 나타난다.
- 색수차(chromatic aberration): 두꺼운 절편의 상이 흐릿하게 보이는 것은 색수차에 의한 것이다. 두꺼운 시료에서 관찰하고자 하는 구조물과 바탕 사이에 대비가 낮으면, 두꺼운 절편을 전자선이 통과할 때에는 에너지 손실이 크다.
- 비점수차(astigmatism): 여기에 색수차의 영향이 더하여져서 대비가 약하게 되고 상이 흐려진다. 조리개를 오래 사용함으로서 조리개 구멍 주위가 오염되는 경우가 있는데, 이것은 주로 탄화수소가 굳어져서 만들어진 절연물로 생긴다. 이 절연물에 전자선이 닿게 되면 대전효과(charge-up)를 일으켜 비점수차가 야기된다. 비점수차를 줄이기 위해서는 수정 장치를 사용하나, 비점수차 발생을 가능한 방지하는 데에는 조리개를 정기적으로 청소하고 작은 조리개 구멍을 가급적 사용하지 않는 것이 중요하다.
과학적 발전에의 기여
미생물학은 전자현미경(EM)과 부가적으로 연관된 다양한 방법을 통해서 커다란 발전이 이루어졌다. 미생물 세계에 대한 우리의 이해를 변화시켰던 EM의 몇 가지 중대한 기여들이 아래에 열거되어 있다:
- 진핵생물(eukaryote)과 원핵생물(prokaryote)간의 구별: EM을 통해서 두 가지 종류의 세포구조가 자연에 존재한다는 것이 입증되었다. 이들 생물은 구조에서 크게 차이가 있다. 한 가지 구조적 단위로서 원핵세포는 그 유전물질을 둘러싸는 분리된 막을 가지고 있지 않다. 반면에 진핵세포는 핵물질이 분리된 핵막에 의해 둘러싸여있는 세포로 구성된다는 것이 밝혀졌다.
- 막 구조: TEM을 통해서, 얼린 세포가 파괴로 생긴 단면에서 세포막의 지질 이중막의 소수성 안쪽으로 어떤 물질을 통과시킨다는 것이 알게 되었는데, 이는 세포막의 두개의 내면을 밝히는 데 기여하였다. 이들 두 면에는 체계적으로 박혀있는 주로 커다란 단백질의 작은 입자들이 존재하는 것이 입증되었다.
- 편모(flagella)구조: 세포 외막에 존재하는 편모장치에서 회전가능한 기저부에 외부필라멘트(external filament)와 결합된 고리(hook)로 구성된 세균의 편모구조는 TEM을 사용하여 규명되었으며, 이를 통해서 구조와 기능에 근거한 편모의 작동 모델이 밝혀졌다.
- 선모: 어떤 세균의 표면으로부터 단백질 돌출부의 존재가 TEM으로 관찰되었다. 선모(fimbriae)와 필리(pili)라고 불리는 이들 구조가 표면에 부착하거나 한 세포에서 다른 세포로 유전물질을 전달하는 등의 기능과 연관된다는 것이 밝혀졌다.
- 그람양성과 그람음성 세포막의 구조: 세균의 박절을 통해서 그람양성 세균에 세포막의 외부에 두꺼운 세포벽 펩티도글리칸 층이 존재한다는 것을 밝혔다. 그람음성 세균에는 외막(outer membrane)인 이차막의 존재가 매우 얇은 펩티도글리칸 층과 세포막 밖에 발견되었다. 그람음성세균에서 내막과 외막 사이에는 주변세포질 공간(periplasmic space)이 존재하는 것이 입증되었는데, 세포생장을 위한 일정한 내부 환경을 조성하는 데 기여하는 것으로 생각된다.
- 염색체(chromosome) 구조: 세균 유전물질의 중요한 구조물로서 거대한 환형의 DNA 분자의 존재가 TEM에 의해 확인되었다. 이 이중가닥의 DNA 염색체는 세포의 리보솜이 없는 부분에서 발견되었다. 세포로부터 노출된 이 염색체는 심하게 접혀있고 꼬여있는 것이 명백한데 이는 DNA가 초나선의 형상으로 존재한다는 것을 입증하였다. 전자현미경은 "nicks"의 존재를 입증하기 위해서 사용되었다.
- 플라스미드(plasmid): 투과전자현미경은 세균에서 작은 환상의 자가복제하는 이중가닥의 DNA 분자가 존재한다는 것을 입증하는데 중요한 역할을 하였다. 플라스미드는 보통 약제내성을 코딩하며, 유전공학에서 널리 이용된다.
- 리보솜 구조: 30S와 50S 소단위로 구성된 70S 리보솜의 형태 모델을 개발하는 일은 TEM 현미경사진을 이용하여 이루어졌다. 체계적인 구조에는 단백질합성에 관여하는 구성단위를 포함하며 성장하는 폴리펩티드 연쇄체와 mRNA 분자 두 가지가 수용된 공간도 존재한다.
- 미토콘드리아(mitochondria) DNA: 전자현미경 관찰을 통하여 효모(yeast)와 원생동물(protozoa), 다른 진핵생물에서 미토콘드리아 DNA에서 이들 세포를 고정시켜 박절편과 코팅된 그리드 상에서 정제된 미토콘드리아에서 얻은 DNA 분자가 존재하는 것이 입증되었다. 이 연구는 어떤 진핵생물체와 세균 간의 진화학적 상관관계를 확립하는데 도움이 되었다.
- 원형질 섬유: 투과전자현미경을 사용하여 미세소관(microtubules), 미세섬유(microfilaments), 중간섬유(intermediate filaments)와 같은 진핵세포에서 단백질로 구성된 세포소기관의 존재가 관찰되었다. 이들 섬유상 단위체(fibrillar units)는 세포의 형태를 변화 또는 유지시키고 수송과 염색체의 분리와 같은 활성을 수행하는 기능을 한다.
- 세포내 소기관: 전자현미경을 이용하여 세포를 관찰하는 과정에서 단일막을 가지고 내부에 입자성 매트릭스를 포함하는 미소체(microbodies)라는 진핵세포에 존재하는 작은 입자(0.5 ㎛)가 밝혀졌다. 그 후 이들 소기관이 다양한 효소 기능을 가지고 있다는 생화학적 증거가 밝혀졌다.
- 종양유전자 산물: 라우스 육종바이러스(Rous sarcoma virus)에 감염된 세포에서 종양유전자 산물(oncogene products)이 존재하는 위치가 감염세포의 원형질막에 있다는 것이 확인되었다.
- 세포독성 사멸: 주사전자현미경과 투과전자현미경은 세포독성 T세포(cytotoxic T cell)가 접촉하여 표적세포는 파괴시키는 단백질을 분비하여 암세포를 파괴하는 방식을 입증하는데 사용되었다.
- 바이러스 조립: 동물성 바이러스(virus)가 숙주세포의 정상적인 생화학적 기구를 이용하여 더 많은 바이러스를 얻는 방법은 전자현미경의 사용으로 비약적으로 발전되었다.
- 프리온과 바이로이드: 전자현미경을 통해서 바이러스보다 간단한 구조를 가지고 있으면서 세포를 감염시킬 수 있는 존재를 이해하는데 기여하기도 하였다. 예를 들어, 프리온(prion)은 질병을 일으킬 수 있는 단백질만으로 구성되며, 바이로이드(viroid)는 단일가닥의 RNA로 일부 식물을 감염할 수 있다.
관련용어
미생물(microorganism), 세균(bacterium), 진핵생물(eukaryotes), 원핵생물(prokaryote), 편모(flagella), 선모(pili), 염색체(Chromosome), 플라스미드(plasmid), 미토콘드리아(mitochondria), 효모(Yeast), 원생동물(protozoa), 바이러스(virus), 프리온(prion), 바이로이드(viroid), 초미세박편기(ultramicrotome), 투과전자현미경(transmission electron microscope; TEM), 음성염색법(negative staining), 주사전자현미경(scanning electron microscope; SEM), 광학현미경(optical microscope)
집필
오계헌/순천향대학교
감수
석영재/서울대학교
참고문헌
1. 권건영, 김영호, 장은숙 2004. 전자현미경 기법. 정문각.
2. Bozzola, J.J. and Russel, L.D. 1999. Electron Microscopy (2nd ed.). Boston: Jones and Bartlett Publishers, Inc.
3. Dillaman, R. and Gay, D.M. 2004. Electron microscopy lab manual. University of North Carolina Wilmington.
4. Todd, W.J. and Scocolofsky, M.D. 1992. Electron Microscopy, Microbial. Encyclopedia of Microbiology. Vol. 3. Academic Press.
동의어
Electron microscope, electron microscope, 전자현미경(Electron microscope), 전자현미경