초박편제작기
[ ultramicrotome ]
초박편제작기(ultramicrotome)는 전자현미경(electron microscope)을 이용하여 관찰하는 시료를 준비하기 위해 특수하게 제작된 박절기로서 20~50 ㎚ 정도의 두께로 얇게 박절하는데 사용되는 도구이다. 이는 생물시료 뿐만 아니라, 고분자, 고무, 플라스틱 및 연질 금속 등의 다양한 재료들의 초박절편을 만드는데도사용된다. 조직 절편의 박절 시에 에폭시 수지를 포매제로 사용하며, 유리칼 또는 다이아몬드 칼을 이용하여 박절한다.
목차
초박편의 제작 과정
시료를 박절(sectioning)하기 위하여 시료의 윗면을 잘 다듬은 후, 관찰하고자 하는 시료의 면이 잘 나오도록 하여 박절하기 좋은 모양으로 만들기 위해 다듬는 과정(trimming)을 거친다. 시료를 너무 예리하게 준비해도 박절할 때 진동의 원인이 되고 일정한 모양의 절편이 나오지 않는다. 따라서 시료는 사다리꼴로 옆면이 피라미드형으로 각도가 45~75°로 적당히 다듬어지도록 해야 한다. 시료는 초박편제작기의 홀더에 고정시키고 설정된 절편 두께에 따라서 약간 앞쪽으로 시료를 이동시킨다.
절편은 초박편제작기에 고정된 유리칼이나 다이아몬드칼 같은 매우 날카로운 칼날에 시료가 수직으로 움직이면서 만들어진다. 칼날에서 직접 절편을 옮기는 것은 시료가 매우 얇게 절편 되어 있기 때문에 어렵다. 전자현미경을 위한 시료를 준비하기 전에 절편과정 이후에 물이 담긴 수조의 표면에서 절편을 수집한다.
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초박편제작기의 부분 명칭. 1. 쌍안(binoculars), 2. 배율 손잡이(magnification knob), 3. 초점 손잡이(focus knob), 4. 전후진 쌍안 조절나사(moves binoculars forward and backward), 5. 조명스위치(light switch), 6. 안내(案內)스테이지(stage with guides), 7. 스테이지 진행손잡이(stage course advance knob), 8. 캔틸레버 암 경로 진행손잡이(cantilever arm course advance knobs), 9. 절단 핸들(cutting wheel), 10. 전동부 조종간(control lever for motor drive), 11. 캔틸레버 암 리셋 손잡이.
칼의 종류와 원리
초박편제작기는 전자현미경으로 시료를 관찰하기 위하여 초박절하는 장비로서 박절에 필요한 칼은 가장 중요한 요소이다. 사용하는 칼에는 주로 유리칼 또는 다이아몬드칼이 사용된다.
유리칼1950년에 유리칼이 초박편제작기에 처음으로 사용되었다. 유리는 잘 깨지지 않으며 간단한 방법에 의해 자를 수 있기 때문에 이상적인 재료이다. 일반적으로 사용되는 판유리는 결함이 있기 때문에, 실험에 필요한대로 완벽하게 잘라지지 않는다. 유리는 적당한 절단력을 가지며 다이아몬드 칼보다 값이 싸기 때문에 전자현미경에서 이상적인 재료이다. 유리칼로부터 얻어진 박편(sections)은 시료의 성질, 포매제의 경도, 블록면의 크기, 그리고 절편의 두께 등과 같은 많은 요소에 의존된다.
유리칼로 자른 절편은 다이아몬드칼로 자른 절편과 비교하여 다소 질이 떨어진다. 또한 유리칼은 검경하고자 하는 시료의 종류에 따라 사용에 있어서 다소 한계를 나타낸다. 그러나 유리칼은 보편적으로 널리 사용되고 있으며 박절이 진행되기 바로 전에 준비하는 것이 좋다.
- 준비: 4' x 12' 크기의 판유리는 절단법(free-break method)에 의해 유리칼을 준비하는데 사용된다. 칼을 만드는데 필요한 도구는 유리프라이어(glazier's plier)와 유리커터(glass cutter)이다. 테이블에 유리 한 장을 올려놓고 자와 유리칼을 사용하여 길이가 약 1/2인치인 새김눈을 긋는다. 유리판은 테이블의 모서리에 평행하게 되도록 한다. 새김눈에서 받침을 놓고 전체적으로 고르게 서서히 압력을 가하여 4' x 4', 2' x 4', 1' x 1'의 크기로 순차적으로 자른다. 이같이 얻어진 각 1' 유리조각은 적어도 인접한 2개의 절단면(free break sides)를 가지고 있으며 보통 한 개의 좋은 칼이 생산된다.
- 검사: 박절하기 전에 유리칼의 각은 점검하는 것이 좋은데, 이 점검은 해부용 현미경을 이용하여 수행될 수 있다. 확인표시 또는 새김눈은 박편하기에 적당한지를 나타낸다. 박절편의 바깥쪽에서 끝이 말리거나 미세 돌출부위가 생기는 것은 최상의 유리칼에서 조차도 흔한 일이다. 조금 볼록한 형태의 칼날은 흔히 사용하는데 있어서 가장 예리하고 내구력이 있다.
- 보관: 저장하는데 본질적인 문제를 피하기 위하여 필요에 따라 그때그때 칼을 만드는 것이 가장 좋다. 그러나 저장하고자 한다면 덮개로 싸서 단단한 재질의 상자 바닥에 양면테이프로 붙여 그 박스를 먼지가 없는 서랍에 두는 것이 좋다. 이런 방법으로 유리칼의 저장 중에 손상을 방지할 수 있다.
- 트로프: 트로프(trough)는 액체를 담기 위하여 유리칼에 부착되며 그 곳에 절편이 떠있게 된다. 판매되는 트로프는 녹이 슬지 않는 금속으로 만들어져 있으며 먼지가 묻지 말아야 하며 수시로 청소를 통해서 부드럽게 해야 한다. 이를 위하여 트로프를 무수알코올(absolute alcohol)에 저장하는 것이 종종 편리하다. 트로프는 칼 가까이 장착시키고 칼날에 접근시켜 파라핀왁스나 밀납을 얇게 발라서 방수가 되도록 한다. 이 왁스는 녹여서 트로프의 외부 하단의 가장자리에 바르고 작은 주걱으로 칼에 부착시킨다. 칼의 절단면에 왁스가 묻는 것을 방지하기 위하여 조심해야 한다.
- 초박편제작기에 칼의 장착: 칼과 트로프는 칼홀더로 잘 맞도록 한다. 그 후 틈새각(clearance angle)은 정확한 각도로 조정한다. 틈새각은 일정 각도 이상이 되어서는 안된다. 그렇지 않으면 박절단면에 지장을 초래하고 칼에도 손상이 초래될 수 있다. 그것이 깨지기 쉽기 때문에 칼을 다루는데 주의해야 하는 것이 중요하다.
- 각도: 틈새각(clearance angle)과 칼의 각도(knife angle)는 봉입(mounting)하고 박절(sectioning)하는데 중요한 요소이다. 틈새각은 칼의 절단면과 박절되는 블록면 사이에 형성된다. 칼의 절단면은 시료 블록면으로 일정한 각도로 기울어져 있다. 그 각도는 블록면이 박절 후에 칼의 뒷면을 긁는 것을 방지하기 위해서 필요하다. 절단각(∠A)는 깨끗하게 아무런 소리가 나지 않아야 하며 가능한 작게 2~5° 이내로 유지되어야 한다. 이 때 고려해야 할 것은 칼의 각도인데 이것은 박절의 압축을 최소로 유지하는데 중요하다.
- 세척: 칼날은 아세톤으로 적신 연질 목재로 닦을 수 있다. 조심스럽게 압력을 가하고 밀 때는 한 방향으로만 해야 한다. 마지막으로 칼은 잘 닦아서 건조시킨다. 일반적으로 실험실에서는 초음파세척법 사용을 선호한다. 칼은 비눗물이 담긴 용기에서 약 5분간 초음파로 처리한다. 그 후 증류수, 아세톤, 마지막으로 메탄올로 닦는다. 칼은 건조시켜 홀더에 넣어 보관한다.
1956년 Fernandez-Moran는 연삭광택기법(grinding and polishing method)에 의해 산업용 다이아몬드로 칼을 만드는 방법을 개발하였다. 40~60° 사이의 절단각도(cutting angle)를 가지고 산업적으로 이용할 수 있는 다이아몬드 칼은 경화된 생물소재를 절단하는데 있어서 유리보다 더 우수하다. 다이아몬드 칼은 깨지기 쉽고 값이 비싸기 때문에 전자현미경에 대한 경험이 있는 사람에 의해서만 사용되어야 한다.
- 장점과 단점: 다이아몬드 칼의 장점은 ① 얇은 절편을 얻을 수 있다; ② 줄어들지 않는 최상의 한 가지 모양의 절편을 얻을 수 있다; ③ 길게 연속적인 절편을 쉽게 얻을 수 있다; ④ 유리칼 절편제작과 비교하여 시간이 훨씬 절약된다 (유리칼의 1/3 정도); ➄ 나이프 교환 작업이 필요없고 온도에 변화가 없는 점 등이 있다. 또한 단점으로는 ① 칼의 가격이 상당히 비싸다; ② 칼날에 흠집이 생긴 경우에 흠집난 부위는 재연마를 하지 않으면 사용하지 못하다; ③ 고가의 칼이므로 사용 후 청소와 공기나 먼지가 끼지 않도록 철저한 관리가 필요하다.
- 용도 및 재료: 다이아몬드 칼의 용도는 생물시료의 초박절편 제작과 금속재료공학의 고분자, 연한 물질, 세라믹, 플라스틱, 결정, 유리, 고무 등을 절단하는데 널리 쓰이고 있다. 다이아몬드 칼은 공업용 다이아몬드가 재료이다.
- 종류와 사양: 초박절편용 다이아몬드 칼은 칼 각도(35°, 45°, 55°), 절편두께(30 ㎚, 150 ㎚), 칼의 폭(1.2 ㎜, 4.0 ㎜) 등이 다양하다. 예를 들어, 칼의 각도가 45°용(통상 초박절편용 나이프로 추천되며, 현재 제일 많이 사용됨), 35°용(생물 및 재료계통 시료에 사용되며, 절삭 중에 일어나는 수축, 절편이 휘어지는 등의 손상을 감소시킬 수 있음), 55°용(세라믹, 결정, 유리, 산화물 등의 단단한 물질의 절편제작에 사용하기 적합함)로 되어 있어 절단하고자 하는 시료에 따라 선택할 수 있다.
- 세척: 다이아몬드 칼의 사용 후 칼날의 세척은 매우 중요한 과정으로 칼날 주위의 지저분한 부위를 깨끗이 세척하여야 한다. 칼날은 물을 싫어하는 경향이 있으므로 폴리스틸렌 봉으로 세척에 가장 적합한 용액을 발라서 칼날에 균일하게 사용하면 칼날이 깨끗이 세척된다.
- 재연마: 고가의 다이아몬드칼도 장시간 사용하면 칼날이 마모되어 칼자국이 절편에 생기고, 절편이 분리되어 절삭되는 현상이 나타나면 칼날을 재연마하여야 하는데 재 연마하는 기간은 2∼3개월 정도 걸린다. 재연마한 경우 사용기간은 약 1년 정도 사용할 수 있다.
절편의 두께 결정
절편의 두께는 올바른 검경을 위해서 매우 중요한 요인이다. 절편과 빛의 간섭현상에 의하여 착색되는 정도에 따라 두께를 판정한다. 절편의 색조와 두께의 관계는 회색(gray, 60 ㎚ 이하), 은색(silver, 60~90 ㎚), 금색(gold, 90~150 ㎚), 자색(purple, 150~190 ㎚), 청색(blue, 190~240 ㎚)로 구분될 수 있다. 절편의 두께를 판정하기 위하여 절편두께 결정용 간섭카드(interference card)를 흔히 사용한다.
절단두께 결정용 간섭카드 ()
초박편 제작 시 문제점과 대책
초박편제작시 발생하는 문제점에는 다음과 같은 경우들이 있을 수 있다. 예를 들면, (1) 초박편 앞부분이 박절되는 않는 경우: 칼날의 각도가 맞지 않거나, (2) 초박편이 찢어지는 경우: 칼날이 무디거나 시료준비 과정이 적절하지 않아서 일어나는 현상이다. 칼날의 뒷부분이 오염된 경우에도 찢어질 수 있다, (3) 초박편이 덩어리지거나 수축되는 경우: (4) 초박편의 두께가 일정하지 않는 경우: (5) 초박편이 연속해서 만들어지지 않는 경우: (6) 초박편이 블록에 달라붙는 경우: 등이 있는데 보다 구체적인 원인과 그 대책에 대하여 [표 1]에 구체적으로 기술되어있다.
| 문제점 | 원인 | 대책 |
|---|---|---|
| 절단이 안된다 | 초박편제작기가 진행방향의 끝부분에 위치하였다 | 초박편제작기를 리셋한다 |
| 칼날이 무디다 | 칼을 교환한다 | |
| 칼이나 블록이 단단하게 고정되지 않았다 | 칼과 시료블록을 단단히 고정시킨다 | |
| 틈새각(clearance angle)이 너무 작하다 | 틈새각을 크게 한다 | |
| 블록이 너무 연하다 | 하루 동안 60° 이상으로 열을 가거나 새 블록으로 교체한다. | |
| 시료블록면이 젖어있다 | 렌즈페이퍼로 블록면을 건조시킨다 | |
| 진동과 온도 변화가 있다 | 진동의 원인과 온도변화를 점검한다 | |
| 트로프에 물이 너무 적다 | 트로프에 물을 채운다 | |
| 절편마다 두께가 다르다 | 칼날이 무디다 | 유리칼을 교환한다 |
| 실험실 온도가 부적절하다 | 외풍과 에어컨을 확인한다 | |
| 실험실에 진동이 있다 | 수동핸들을 제외하고 초박편제작기나 테이블을 만지지 않는다 | |
| 시료블록칼이나 칼홀더가 느슨하다 | 단단하게 조인다 | |
| 절단속도가 너무 빠르거나 늦기 때문일 수 있다 | 절단속도를 조정한다 | |
| 블록면이 불규칙하거나 너무 크다 | 블록면을 1 ㎜ x 1 ㎜로 절단한다 | |
| 초박편제작기에 결함이 있다 | 강사에게 문의하여 초박편제작기를 점검한다 | |
| 블록이 너무 연하다 | 60°에서 블록을 중합시키거나 새 블록을 사용한다 | |
| 칼의 각도가 맞지 않다 | 적당한 각도로 칼을 조정한다 | |
| 틈새각이 음각일 수 있다 | 적절한 상태로 각도를 조정한다 | |
| 절편에 주름이 생긴다 | 칼날이 더럽다 | 유리칼을 교체한다 |
| 시료의 포매가 불충분하다 | 새 블록을 사용한다 | |
| 틈새각이 너무 크다 | 틈새각을 줄인다 | |
| 수면이 너무 낮다 | 트로프에서 수면을 높인다 | |
| 칼날이 무디다 | 칼을 교체한다 | |
| 시료블록이나 칼이 느슨하다 | 블록이나 칼을 단단하게 조인다 | |
| 블록면이 너무 크다 | 면을 적절한 크기로 다시 다듬는다 | |
| 칼의 각도가 크다 | 칼의 각도를 작게 조정하여 사용한다 | |
| 절단속도가 빠르다 | 절단속도를 줄인다 | |
| 절단속도의 변화가 생긴다 | 일정한 속도로 절단한다 | |
| 절편이 불규칙한 두께를 가진다 | 칼날이 무디다 | 유리칼을 교체한다 |
| 시료의 포매가 불충분 하다 | 새 블록을 사용한다 | |
| 시료블록 또는 칼이 느슨하다 | 블록이나 칼을 단단하게 조인다 | |
| 절단속도가 불규칙하다 | 일정한 속도로 절단한다 | |
| 절편들이 압착된다 | 블록이 너무 연하다 | 60°에서 블록을 중합시키거나 새 블록을 사용한다 |
| 절편이 넓게 퍼진다 | 절편을 클로로포름 증기에 노출시킨다 | |
| 절단 중 소리가 난다 | 연구실에 진동이 있다 | 단단하게 설치되어 있는지 점검한다; 초박편제작기를 만지지 않는다; 일정한 절단리듬을 유지한다 |
| 절단속도가 너무 빠르다 | 절단속도를 줄인다 | |
| 블록면이 너무 크다 | 크기를 작게 한다 | |
| 연구실, 시료온도가 너무 높다 | 온도를 낮춘다 | |
| 시료블록이 홀더로부터 너무 멀리 늘어나있다 | 블록을 홀더 안으로 밀어 넣는다; 필요하다면 블록 길이를 짧게 한다 | |
| 다듬은 시료의 끝이 연필 모양이다 | 다시 다듬어 시료의 면을 짧게 한다 | |
| 칼이 무디다 | 유리칼을 바꾼다; 칼의 다른 부분을 사용한다 | |
| 시료블록이 너무 단단하다 | 블록을 교체한다 | |
| 시료블록이 너무 연하다 | 하루이상 60°에서 가열한다; 블록을 교체한다 | |
| 시료블록, 칼 또는 칼홀더가 느슨하다 | 단단하게 조인다 | |
| 칼이 너무 높게 설치되었다 | 칼의 높이를 조절한다 | |
| 박절편 제작 중에 소리가 나거나 절편이 칼날에 묻는다 | 트로프에 수분량이 적다 | 트로프에서 메니스커스(meniscus) 높이를 조절한다 |
| 칼날이 무디다 | 유리칼을 바꾼다; 다이아몬드칼의 다른 부분을 사용한다 | |
| 칼날이 더럽다 | 유리칼은 교체하고 다이아몬드칼을 잘 닦는다 | |
| 칼의 각도가 작다 | 칼의 각도를 적절하게 세팅한다 | |
| 블록면에 이물질이 붙어있다 | 흡습지로 닦아내거나 집진기로 제거한다 | |
| 블록면이 칼날위로 절편을 들어올린다 | 트로프의 수면이 너무 높다 | 트로프의 수면을 낮춘다 |
| 블록면에 물방울이 있다 | 흡습지로 블록면의 물기를 흡수시킨다 | |
| 틈새각이 너무 작다 | 칼을 기울여 틈새각을 크게 한다 | |
| 칼날이 오염되어있다 | 유리칼을 바꾼다 | |
| 블록면에 먼지가 있다 | 흡습지로 닦는다 | |
| 칼날의 면에 물방울이 있다 | 흡습지로 수분을 흡수시킨다 | |
| 블록면이 전하를 띤다 | 블록면을 깨끗한 흡습지로 접촉시키거나 실내습도를 높인다 | |
| 블록이 연하다 | 하루이상 60°에서 중합시키거나 새 블록을 사용한다 | |
| 절편에 줄이 생긴다 | 칼날에 결함이 있다 | 유리칼을 교체한다; 칼의 다른 부분을 사용한다 |
| 칼날이 더럽다 | 유리칼을 교체한다; 칼의 다른 부분을 사용한다 | |
| 블록에 지저분한 이물질이 있다 | 이물질을 제거하거나 새 블록을 사용한다 | |
| 절편에 구멍이 생긴다 | 블록면에 기포가 존재한다 | 이물질을 제거하거나 새 블록을 사용한다 |
| 포매가 잘 안되었다 | 새 블록을 사용한다 | |
| 시료가 블록에서 빠져 나온다 | 포매가 잘 안되었다 | 새 블록을 사용한다 |
| 리본이 만들어지지 않는다 | 트로프에 물이 많이 있다 | 트로프에서 물의 양을 줄인다 |
| 블록면 쪽이 나란히 되어 있지 않다 | 블록면을 다시 다듬는다 | |
| 블록면의 상하부의 가장자리가 똑바르지 않다 | 블록면을 다시 다듬는다 | |
| 절단속도가 너무 빠르거나 늦다 | 절단속도를 적절히 조절한다 | |
| 블록면이 전하를 띤다 | 블록면을 깨끗한 흡습지로 접촉시킨다; 습도를 높인다 | |
| 불규칙한 박절 속도 때문이다 | 규칙적인 주기로 블록을 박절한다 | |
| 시료 블록면이 절단 중에 젖는다 | 트로프에서 수면이 너무 높다 | 트로프의 수면을 낮춘다 |
| 시료내부로 포매제가 잘 침투되지 않았다 | 새 시료블록을 사용한다 | |
| 절단면 뒤쪽에 물방울이 생긴다 | 흡습지로 물방울을 흡수한다 | |
| 블록면 또는 칼날이 더럽다 | 블록면을 습기가 있는 흡습지로 닦는다 | |
| 박절을 실체현미경(stereomicroscope)으로 보기 어렵다 | 트로프의 수면이 너무 높거나 낮다 | 트로프의 메니스커스를 조정한다 |
| 조명 투사각이 정확하지 않다 | 조명투사각 조정한다 | |
| 리본이 연속적이지 않다 | 블록면 우측과 좌측의 길이기 고르지 않다 | 블록면을 적당한 형태로 다시 다듬는다 |
| 블록면의 상하부 가장자리가 똑바르지 않다 | 블록면을 적당한 형태로 다시 다듬는다 | |
| 트로프에 물이 너무 많다 | 트로프의 메니스커스를 낮춘다 |
†트로프(trough): 마이크로톰의 절단을 통해서 생기는 절편 또는 리본을 받는 홈통.
†메니스커스(meniscus): 표면장력에 의하여 액체가 벽면과의 접촉면에서 곡면을 이루는 것.
집필
오계헌/순천향대학교
감수
석영재/서울대학교
참고문헌
1. 권건영, 김영호, 장은숙 2004. 전자현미경 기법. 정문각.
2. 제갈승주 외 22명 2012. 조직검사학 (5판.). 고려의학.
3. Bozzola, J.J. and Russel, L.D. 1999. Electron Microscopy (2nd ed.). Boston: Jones and Bartlett Publishers, Inc.
4. Dillaman, R. and Gay, D.M. 2004. Electron microscopy lab manual. University of North Carolina Wilmington.
5. Wagner, R. 2006. Ultramicrotomy and staining of thin sections. Accessed Sept. 2006. of Delaware.
동의어
초미세박편기, ultramicrotome, Ultramicrotome, 초박편제작기, 초박편제작기(Ultramicrotome)