플라스미드

플라스미드(plasmids)는 생장에 필수적인 염색체(chromosom) DNA에서 물리적으로 분리되어 있는 대표적인 에피솜(episome) DNA 분자이다. 1952년 미국의 유전학자 J. 레더버그가 최초로 플라스미드를 세균의 염색체 이외의 독자적으로 증식할 수 있는 DNA 분자라는 의미로 명명하였다.

플라스미드 모식도 (출처: 하남출/서울대)

목차

플라스미드는 1 kilo base에서 1 Mega base에 이르는 다양한 크기로 존재하며 대부분 환형이지만 선형 플라스미드도 관찰된다. 세포에서 분리한 플라스미드는 가장 압축된 상태인 초나선형(supercoil)으로 존재한다. 플라스미드는 자신의 복제기점을 소유하여 염색체와는 독립적으로 복제되어 증식할 수 있다. 하지만 복제과정에 필요한 효소들은 숙주 염색체에 의존하는 것으로 알려진다. 플라스미드가 세포내에 존재하는 숫자가 다른데, 이것을 복제수 (copy number)라고 한다. 이러한 복제수는 플라스미드 상에 있는 유전자와 숙주와 플라스미드 사이의 상호작용에 의해 결정된다. 일부 진핵생물에서도 존재하지만 주로 세균에서 많이 발견되며 바이러스와는 달리 세포내에서만 존재한다. 플라스미드는 한가지 이상의 유전자를 암호화하고 있는데, 숙주의 생장에 필수적인 유전자를 지니지는 않지만 특정 환경에 생존하기 위해 중요한 기능을 수행하는 경우가 많다.

pUC19 지도. amp는 앰피실린 항생제 내성 유전자, ori는 플라스미드 복제 기점, lacZ는 beta-galactosidase 유전자, polylinker는 여러가지 제한효소자리를 가지고 있는 서열이다. polylinker는 beta-galactosidase 유전자 중간에 있으므로 polylinker 사이에 다른 서열이 들어간 경우 정상적인 beta-galactosidase의 유전자 발현이 이루어지지 않는다. (출처: 하남출/서울대)

플라스미드는 세균 내에서 분리되어 새로운 숙주세포 안으로 전달될 수 있는데, 이와 같이 쉽게 형질전환이 가능한 플라스미드를 이용해 유전자공학에 광범위하게 이용되고 있다. 세균에서 DNA를 추출하고 다중 제한효소 클로닝 부위가 존재하는 벡터를 활용하여 재조합된 DNA서열의 복제를 촉진하기 위해 사용된다. 또한 원하는 유전자를 세포 내에서 단백질로 발현하기 위해 발현 벡터가 사용되기도 한다.

항생제 또는 다른 생장 저해물질에 대한 내성을 가지는 플라스미드. 접합(conjugation), 형질전환(transformation), 형질도입(transduction)에 의해 다른 세균으로 수평적으로 전달될 수 있다. 항생제가 존재하는 환경에 서는 자연선택에 의해 저항성 플라스미드가 있는 세균만 선택되어 생존한다. 한 세균이 다수의 저항성 유전자를 가질 경우 다제내성을 가진 일명 수퍼박테리아가 될 수 있다. RP4 (54 kb)와 같은 플라스미드를 예로 들 수 있다.

장내세균에서 관찰되는 F 플라스미드 (95-100 kb)는 세균의 접합(conjugation)에 필요한 유전자를 암호화하고 있으면서, 동시에 IS 서열을 가지고 있어 숙주 염색체로 삽입될 수 있는 특성이 있다. 이러한 특성으로 인해 염색체 상의 유전자를 다른 세균으로 전달할 수 있는 특성을 가진 플라스미드이다. 약 100 여개의 유전자를 가지고 있다. (스스로 복제할 수 있는 유전자. 접합에 필요한 pili를 생성할 수 있는 유전자 등)

장내세균에서 관찰되는 ColE1 플라스미드 (9 kb)는 bacteriocin(유사한 세균을 죽이거나 생장을 억제하는 좁은 항균범위를 가지는 항균단백질)의 일종인 colicin을 암호화하는 플라스미드로 다른 strain의 세균을 죽일 때 사용된다. pUC19와 같은 대장균에서 사용되는 다양한 플라스미드들이 ColE1 플라스미드를 변형하여 개발되었다.

자연에서 흔히 발견되지 않는 유기화합물을 분해할 수 있는 유전자를 가지고 있는 플라스미드. 분해성 플라스미는 다양한 자연계에 존재하는 물질 혹은 인간이 만든 물질을 분해하는 세균으로 부터 분리할 수 있다. Pseudomonas putida에서 발견되며 200 kb에 달하는 CAM 플라스미드, TOL 플라스미드 등을 에로 들 수 있다.

숙주에 집락화하고 감염되어 숙주에게 피해를 주는 독소를 생산하는 유전자를 암호화하는 플라스미드. 대장균의 경우 대부분 병을 일으키지 않지만, 병원성 플라스미드를 가지고 있는 대장균 strain은 인간에 치명적 병을 일으킬 수 있다. 그 외에 Agrobacterium tumefaciens에서 발견되며 200 kb에 달하는 Ti 플라스미드는 식물의 crown gall을 유발하는 대표적인 병원성 플라스미드이다.

플라스미드는 대장균에 형질전환시켜 도입한 후, 이 대장균을 순수배양하여 증폭(증식)하고, 이를 손쉽게 플라스미드를 분리하여 정제할 수 있다. 염색체 DNA와 분리하는 핵심원리는 변성(denaturation)된 DNA가 renaturation (annealing)되는 속도의 차이를 이용하는 것인데, 염색체 DNA 처럼 크거나 분리과정에서 선형으로 전환되는 DNA는 renaturation되는 데 오랜 시간이 걸리는 데 비해, 플라스미드처럼 작은 환형 DNA는 renaturation이 상대적으로 빨리 이루어진다. DNA를 denaturation하는 방법으로는 열을 가하거나 염기용액을 사용하는 방법이 있는데, 여기서는 염기용액을 이용하는 방법을 소개한다.

1.    10시간 이상 배양한 대장균을 원심분리용 튜브에 옮겨 원심분리를 하여 cell을 모은다.

2.    상층액은 버리고 포도당, EDTA 그리고 완충액이 들어있는 첫 번째 시약을 넣어 세포벽을 약화시킨다. (세포벽의 Mg²⁺가 EDTA에 의해 제거되어 세포벽이 약화됨)

3.    NaOH와 SDS를 포함하는 두 번째 시약을 처리한다. 이때 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)는 지질을 제거하여 세포를 용해시키고 단백질 변성을 유발한다. NaOH는 pH를 12 이상으로 만들어주기 때문에 플라스미드 DNA, 염색체 DNA, 그리고 단백질을 변성시킨다.

4.    아세테이트가 포함되어 있는 세 번째 시약을 처리하면 알칼리성 pH를 중화시켜 변성된 DNA가 다시 재생되는데, 이때 크기가 매우 큰 염색체 DNA의 경우 완벽히 renaturation되지 못하여 엉키게 되고, 플라스미드 DNA는 다시 원래 형태로 되돌아 오게 된다.

5.    원심분리를 하여 renaturation되지 못한 염색체 DNA와 단백질 등이 엉켜 가라앉게 되고, 플라스미드 DNA와 일부 재생된 단백질 등이 상층액에 남게된다.

6.    남아있는 단백질과 탄수화물을 제거하기 페놀, 클로로포름, 그리고 이소아밀알콜 용액을 (25: 24:1) 비율로 첨가한 후 원심분리를 통해 층 분리를 유발한다.

7.    상층액에 에탄올을 처리하여 플라스미드 DNA를 침전시킨다.

8.    에탄올을 모두 제거하여 남아있는 불투명 침전물로부터 플라스미드 DNA를 얻는다.

하남출/서울대학교

조유희/차의과학대학교