중합효소연쇄반응

중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)의 기본적인 원리는 중합효소(polymerase)의 연쇄반응(chain reaction)으로서, 핵산(nucleic acids)의 특정 나선(strands)의 복제본(copies)을 다량으로 획득하기 위하여 사용되는 방법이다. 중합효소연쇄반응은 현재 의학 및 생물연구에서 다양한 응용을 위하여 일반적으로 사용되는 필수적인 기술이다. 이러한 중합효소연쇄반응은 신속하고, 저렴하고, 간단하기 때문에 분자생물학에서 가장 널리 사용되는 강력한 기술 중의 하나이다.

목차

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 몇 가지 크기의 DNA 단편을 하나 또는 몇 개의 복제본(copies)으로 증폭시키는 분자생물학 기술로서 수천에서 수백만의 특정 DNA 서열(DNA sequence)의 복제본을 생성한다. PCR은 1984년에 미국의 생화학자인 Kary Mullis에 의해서 최초로 개발되었는데, 그는 PCR을 개발한 공로로 1993년에 노벨상을 수상하였다. PCR은 현재 의학 및 생물연구에서 다양한 응용을 위하여 일반적으로 사용되는 필수적인 기술이다. PCR은 신속하고, 저렴하고, 간단하기 때문에 분자생물학에서 가장 널리 사용되는 강력한 기술 중의 하나이다.

PCR 기술은 소스 DNA(source DNA)가 상대적으로 품질이 좋지 않은 경우에도 소량의 소스 DNA 물질로부터 특정 DNA 단편(fragments)을 증폭시킬 수 있다. DNA 단편의 무제한적인 복제본을 생성하는 빠르고 쉬운 PCR 방법은 실제로 혁명적인 돌파구처럼 시간을 초월한 최상급의 과학적 발전 중의 하나이다. 의학적 진단의 일상적인 실용성에서 계통분류학(systematics)의 이론적 체계에 이르기까지, 그리고 법의학 분야에서 동물 행동에 대한 현장 연구에 이르기까지 PCR은 극미량의 유전물질, 행여 손상된 유전물질일지라도 새로운 차원의 정확성과 신뢰성으로 분석이 가능하다. 또한 이러한 PCR의 기초에 대한 지속적인 검토로 PCR 기술의 개발과 적용에 대한 많은 기여가 이루어졌다.

PCR의 기본적인 원리는 연쇄반응(chain reaction)으로서 1개의 DNA 분자는 2개의 복제본을 생성하고, 그 후로 4개, 8개 등등을 생성하는 데에 사용된다. 이러한 연속적인 배가 작업(continuous doubling)은 중합효소로 알려진 특정 단백질에 의해서 수행되는데, 중합효소는 개별적인 DNA 빌딩 블록(building blocks)을 함께 연결하여 긴 분자 나선(molecular strands)을 형성할 수 있는 효소이다.

이러한 작업을 수행하기 위해서 중합효소는 DNA 빌딩 블록, 즉 4개의 염기(bases)인 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T), 시토신(cytosine, C) 및 구아닌(guanine, G)으로 이루어진 뉴클레오타이드(nucleotides)를 공급받아야 한다. 중합효소는 또한 프라이머(primer)로 알려진 DNA의 작은 단편을 필요로 하는데, 중합효소는 여기에 새로운 나선을 만들기 위한 주형(templates)으로 사용하기 위하여 보다 긴 DNA 분자뿐만 아니라 빌딩 블록을 부착시킨다. 이러한 3가지 성분이 공급되면, 효소는 주형의 정확한 복제본을 만들 수 있게 된다.

PCR은 핵산(nucleic acids)의 특정 나선의 복제본을 다량으로 획득하기 위하여 사용되는 방법이다. 이는 DNA의 특정 단편(segment)을 선택적으로 증폭시키는 수단이다. 이러한 단편은 인체 유전자의 특정 엑손(specific exon)처럼 DNA의 크고 복잡한 혼합물의 작은 부분을 나타낼 수 있다. PCR은 겔 전기영동(gel electrophoresis)으로 볼 수 있는 사용 가능한 양의 DNA를 2시간 이내에 증폭시킬 수 있다. 주형 DNA는 고순도로 정제할 필요가 없으며, 세균의 집락(colony)을 가열하기만 해도 된다. 이러한 PCR 산물은 제한효소(restriction enzymes)에 의한 절단(digested), 염기서열 분석(sequenced), 또는 복제(cloned) 될 수 있다. PCR은 DNA 단편의 조작을 필요로 하는 거의 모든 연구가 단순성과 유용성의 결과로 수행될 수 있는 방법으로 변형시켰다. 

PCR 기술에는 변성(denaturation), 결합(annealing) 및 확장(extension)의 3가지 주요 단계가 있다. 1단계인 변성에서 DNA는 90~95 ^oC의 고온에서 변성된다. 2단계인 결합에서 프라이머(primers)는 DNA 주형 나선에 결합하여 확장을 준비한다. 3단계인 확장에서는 DNA의 상보적인 복제 나선을 만들기 위해서 결합된 프라이머의 말단에서 확장이 일어난다. 이러한 PCR 주기의 3단계를 통해서 DNA 함량을 효과적으로 배가시킬 수 있다(그림 1)¹⁾. 

그림 1. 중합효소연쇄반응의 3 단계. (그림: 정후길/가천대학교)

PCR을 사용하여 DNA 단편을 증폭시키기 위해서는 시료를 먼저 가열하여 DNA를 변성시키거나 2개의 단일 나선(single-stranded) DNA로 분리시킨다. 다음으로, Taq 중합효소가 원래의 나선을 주형으로 사용하여 2 개의 새로운 DNA 나선을 합성한다. 이러한 과정으로 원래의 DNA가 복제되며, 각각의 새로운 분자는 하나의 오래된 DNA와 하나의 새로운 DNA 나선을 가지게 된다. 그런 다음 이들 각각의 나선을 사용하여 2개의 새로운 복제본을 만드는 등등의 작업을 수행할 수 있다.

결합 단계는 50~60 °C의 낮은 온도에서 이루어지는데, 이렇게 함으로서 프라이머가 각각의 상보적인 주형 나선에 교잡될 수 있게 된다. 주형에 부착된 프라이머의 새롭게 형성된 DNA 나선을 사용하여 원하는 원래의 주형 나선에서 동일한 복제본을 생성할 수 있다. Taq 중합효소는 결합된 프라이머의 말단에 이용 가능한 뉴클레오타이드를 첨가한다. Taq 중합효소에 의한 프라이머의 확장은 약 72 ℃에서 2~5분 동안에 일어난다.

PCR 주기와 과정의 장점은 다른 기술에 비해서 매우 빠르며, 각 사이클이 원하는 DNA 나선의 복제수를 2배로 늘린다는 것이다. DNA 시료에 PCR 과정을 수행한 25~30 사이클 후에는 실험을 수행하기 위한 원본 DNA 샘플을 충분히 복제하게 된다. 각 단계의 최대 시간을 가정했을 때 30 사이클을 완료하는 데에는 단지 6시간이 소요된다.

변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합효소 확장(polymerase extension)이 계속됨에 따라서 프라이머는 원래의 DNA 주형과 새로 합성된 나선의 상보적인 부위 모두에 반복적으로 결합하여 DNA의 새로운 복제물을 생산할 수 있도록 확장된다. 최종적인 결과는 PCR 프라이머 사이의 서열을 포함하는 DNA 단편의 총 수가 기하급수적으로 증가하게 되는데, 이는 이론적 풍부도(theoretical abundance)인 2ⁿ으로 최종적으로 표현되며, 여기서 n은 사이클의 수이다(그림 2)²⁾.

그림 2. 중합효소연쇄반응의 3 사이클 이후의 증폭량. (그림: 정후길/가천대학교)

PCR은 고온에서 안정하게 유지되는 DNA 복제효소의 능력에 의존한다. DNA 중합효소는 110 °C 이상의 간헐천에서 생육하는 Thermus aquaticus(Taq)에서 분리되었기 때문에 활성의 열 안정성이 매우 강하며, PCR의 수율, 특이성, 자동화 및 유용성에 크게 기여하였다. Taq 효소는 94 °C에서의 반복적인 가열을 감내할 수 있으며, 혼합물이 냉각되어 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프라이머가 연장을 위한 촉매(catalyst)에 결합되도록 하는 각각의 시간이 이미 존재한다. 마지막 사이클 이후에는 새로 합성된 PCR 산물의 돌출된 말단을 채우기 위해서 보통 72 °C에서 5 분 동안 시료를 배양한다. 성공을 보장하기 위해서는 반응 혼합물을 준비하고 순환 조건을 설정할 때 주의를 기울여야 한다. 증폭의 특이성은 프라이머가 의도하고 있는 표적 DNA 서열(target DNA sequences) 이외의 서열을 인식하고 결합할 수 있는 정도에 좌우된다.

분자생물학에서 실시간(real-time) 중합효소연쇄반응, 또는 정량적 실시간(quantitative real time) 중합효소연쇄반응은 PCR을 기반으로 하는 실험 기법으로서 표적 DNA 분자를 증폭하고 동시에 정량화하기 위해서 사용된다. 전통적인 PCR은 튜브에서 수행되며 반응이 완료되면 반응 생성물인 증폭된 DNA 단편을 분석하고 겔 전기영동(gel electrophoresis)으로 시각화한다. 그러나 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR, RT-PCR)은 반응이 실제로 진행되는 동안에도 분석이 가능하다. 이는 증폭된 제품과 반응하고 계측기로 측정할 수 있는 다양한 형광염료를 사용함으로써 가능해진다. 이는 또한 DNA의 정량을 용이하게 한다. 현재는 합목적적으로 보다 정확한 결과를 도출하기 위해서 다양한 형태의 변형되고 개선된 PCR 기술이 광범위하게 사용되고 있다³⁾⁴⁾.

이러한 기술이 알려져 있는 정량적 PCR(quantitative PCR, Q-PCR)은 보통 실시간 PCR(real-time PCR) 절차에서 PCR 생성물의 함량을 측정하는 데 사용된다. 이는 DNA, cDNA 또는 RNA의 시작 함량(starting amounts)을 정량적으로 측정하기 위하여 선택하는 방법이다. 따라서 PCR은 DNA 서열이 시료에 존재하는지 여부와 그 시료 내 복제본의 수를 결정하는 데 종종 사용된다. 실시간 PCR의 또 다른 이점은 분석속도가 빠르다는 것인데, 이는 DNA 증폭 반응 후 전기영동 또는 기타 절차를 수행할 필요가 없기 때문이다.

디지털 PCR(digital PCR, dPCR)의 개념은 기존의 PCR 방법을 개선한 것으로서 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함하는 핵산을 직접 정량화하고 클론을 증폭하는 데에 사용할 수 있다. 디지털 PCR과 전통적인 PCR의 주요 차이점은 핵산의 함량을 측정하는 방법에 있는데, 디지털 PCR이 PCR보다 더 정확한 방법이다. PCR은 단일 시료 당 하나의 반응을 수행하며, 디지털 PCR 또한 시료 내에서 단일 반응을 수행하지만, 시료는 많은 수의 구획으로 분리되고 반응은 각 구획에서 개별적으로 수행된다. 이러한 분리는 더 신뢰할 수 있는 수집과 핵산 함량의 예민한 측정을 가능하게 한다.

역 PCR(inverse PCR)은 알려진 서열 하나만으로 DNA를 증폭하는 데 사용되는 PCR의 변형이다. 전통적인 PCR의 1 가지 한계는 표적 DNA의 양쪽 말단에 상보적인 프라이머가 필요하다는 것인데, 역 PCR 방법은 프라이머가 설계될 수 있는 하나의 서열만이 이용 가능할지라도 PCR이 수행될 수 있게 한다.

중첩 PCR(nested PCR)은 예기치 않은 프라이머 결합 부위의 증폭으로 인한 생성물의 오염을 줄이기 위해서 변형된 PCR 방법이다.

터치다운 PCR(touchdown PCR)은 프라이머가 비특이적 서열을 증폭하는 것을 회피할 수 있는 방법이다. 터치다운 PCR 사이클의 가장 초기 단계는 높은 결합(annealing) 온도를 가지고 있다. 이러한 결합 온도는 각 후속 사이클 세트가 증가함에 따라서 감소하게 된다.

PCR은 점점 더 증가하고 있는 질병을 조사하고 진단하는데 유용하다^5)6)7)8). 또한 PCR은 오랫동안 핵산에 관한 연구를 수행하는 모든 실험의 표준 방법이 되어 왔다. DNA 칩(DNA chips)과 같은 경쟁적인 기술조차도 필수적인 예비단계로서 PCR을 통한 DNA 증폭을 필요로 한다. RNA 수준을 평가하기 위한 역전사효소(reverse transcriptase)의 사용과 실시간으로 DNA 증폭을 정량화하기 위한 PCR 기술의 확장은 PCR의 적용성을 크게 발전시켰다.

유전자 발현(gene expression)의 변화에 ​​대한 결정과 정량화가 가능해지면서, 이러한 기술은 현재 질병 과정(disease processes)에 대한 이해도를 보다 높이고 진단 및 기초과학 연구의 토대가 되었다. 예를 들어, 미생물학 및 분자생물학에서 PCR은 DNA 복제 과정, 서던 블로팅(southern blotting), DNA 시퀀싱(sequencing), 재조합(recombinant) DNA 기술 등의 연구에 사용되고 있다. 임상미생물학 실험에서 PCR은 미생물 감염의 진단 및 역학연구에 매우 중요하다. PCR은 법의학 실험에도 사용되는데, 원래의 DNA를 극미량만 필요로 하기 때문에 특히 유용하다. 예를 들어 혈액 한 방울 또는 단일 모발로부터도 충분한 DNA를 얻을 수 있다. 

정성적(qualitative) PCR은 인체 유전자뿐만 아니라 세균과 바이러스의 유전자를 검출하는 데에도 사용할 수 있다. 따라서 고전적인 PCR 방법의 가장 중요한 의학적 응용 중의 하나는 병원성세균(pathogens)의 검출이다. 대부분의 바이러스에는 DNA보다는 RNA가 포함되어 있다. 이러한 경우에 바이러스성 유전체는 PCR이 수행되기 전에 전사되어야 하므로 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)이 사용된다. 때로는 신체 외부의 병원성세균도 검출할 필요가 있다. 다행히도 PCR 방법은 체액(body fluids), 식품 또는 음용수 등의 어떤 시료에서도 미생물의 DNA를 검출할 수 있다⁹⁾.

정량적(quantitative) PCR은 단순한 DNA 검출 이상의 추가적인 정보를 제공한다. 정량적 PCR은 특정 DNA 단편이 시료에 존재하는지 여부뿐만 아니라 어느 정도 존재하는지 나타낸다. 이러한 정보는 표적 연구를 통한 의학진단 테스트부터 기초 연구에 이르기까지 다양한 응용에 필요하다. 정량적 PCR의 또 다른 중요한 용도는 분자적 진단, 즉 생리학적 징후보다는 분자적 발견에 기초한 질병의 진단이다. 이와 관련하여 바이러스성 질병의 진단이 점차 중요해지고 있다. PCR은 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 수두-대상포진 바이러스(varicella-zoster virus) 및 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus infections) 등의 감염에 대해서 가장 민감한 검사이다. 유전질환, 암 및 기타 전염병에 대한 검사를 포함한 기타 진단 용도가 발달하고 있다. 전염병 분야에서 정량적 PCR이 사용되는 또 다른 중요한 응용 분야는 후천적면역결핍증(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)으로서, 감염 후 처음 몇 주 동안에 표준적인 효소결합 면역흡착분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 검사보다 빨리 발견할 수 있다.

암의 전개에는 항상 유전적 요인이 관련되어 있다. 이러한 유전적 요인의 기여도는 암의 유형에 따라서 크게 변하게 된다. 유전자는 질병의 진행을 결정할 뿐만 아니라 이용 가능한 치료법의 효과에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 따라서 암의 발달에 영향을 미치는 유전자를 확인하는 것이 치료를 개선하는 중요한 단계이다.

정성 및 정량적 PCR 모두 암과의 싸움에서 결정적인 역할을 하고 있는데, 이는 PCR이 암의 발병과 관련된 유전자를 확인할 수 있기 때문이다. 실시간 PCR을 위한 수많은 실험적 응용 프로그램이 있는데, 이러한 기술은 일반적으로 기초연구에 사용되며, 진단테스트에서 신종 인플루엔자 등의 새로운 질병을 탐지하는 도구로 사용되고 있다.

디지털 PCR(digital PCR)은 저수준 병원체의 검출 및 정량화, 희귀 유전자 배열, 복제 수(copy number) 변이 및 단일 세포에서의 상대적인 유전자 발현 등을 포함하여 많은 잠재적인 응용 분야를 가지고 있다. 단일 단계 디지털 PCR에 의해서 가능해진 클론 증폭은 대부분의 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS) 방법의 시간과 비용을 줄이고, 개인별 맞춤형 유전체학(personal genomics)을 가능하게 하는 핵심 요소이다¹⁰⁾. 

역 PCR(inverse PCR)은 삽입 위치의 결정에 특히 유용하다. 예를 들어, 다양한 레트로바이러스(retroviruses) 및 트랜스포존(transposons)은 유전체 DNA에 무작위로 통합된다. 그들이 인입된 부위를 확인하기 위해서, 이미 알려진 내부 바이러스성 또는 트랜스포존 서열을 사용하여 인접한 외부 유전체 DNA의 작은 부분을 증폭시키는 프라이머를 디자인할 수 있다.

중첩 PCR(nested PCR)은 임상표본에서 단지 몇 가지 세균만을 검출하기 위한 절차 중의 하나이다. 중첩 PCR(nested PCR)은 법의학 및 기타 인체의 유전 사례에 대한 DNA 지문 채취(DNA fingerprinting)에 대한 사용과 함께 많은 유전학연구의 핵심 부분이다.

통상적인 PCR은 표적 DNA의 말단에 상보적인 프라이머가 필요하다. 흔히 발생하는 문제는 DNA의 잘못된 영역에 프라이머가 결합하여 예기치 않은 산물을 만들어내는 것이다. 실시간 PCR은 인플루엔자 바이러스 A 및 인체면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)와 유사한 레트로바이러스(retroviruses)처럼 유전체가 RNA로 구성된 바이러스의 유전체 연구에 일반적으로 사용된다. PCR은 또한 질병의 치료법을 예측하기 위해서 상당한 정밀도로 사용될 수 있다. 분자 복제는 PCR 기술이 출현하므로서 도움이 되었다. 직접적인 클로닝(cloning)은 PCR에 의해서 증폭된 DNA 단편 및 5' 말단에 첨가된 제한효소 인식 부위(restriction endonuclease recognition sites)를 가지고 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행되었다.

과학의 발전은 단지 반세기 전에는 전혀 예측할 수 없었던 방식으로 인간의 삶을 변화시키고 있다. 분자생물학적 방법은 이러한 측면에서 유망함을 보여주고 있다. PCR 및 그의 응용은 과학적이고 의학적인 유망함을 유지하고 있다. PCR은 매우 빨리 인간의 건강과 삶을 향상시키는 필수적인 도구가 되었다. PCR은 RNA와 DNA 바이러스의 검출에 있어서 완전한 혁명을 일으켰다. PCR은 민감도와 특이성이 높은 신속한 기술이기 때문에 확증 테스트로서 유용하다. PCR은 또한 많은 연구에서 혼합 감염을 용이하게 검출할 수 있는 것으로 인정받았다. 보다 정교한 기술인 PCR은 인프라 지원이 필요하고 비용이 많이 들지만, 그럼에도 불구하고, 현존하는 전통적인 진단 방법에 비해서 많은 실용적인 장점을 무시할 수는 없다.  

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정후길/가천대학교

나도균/중앙대학교

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