클로닝

클로닝(cloning)은 유전 공학의 기초가 되는 기술로, 특정 DNA조각을 분리하여 벡터(vector)라고 불리는 플라스미드 혹은 바이러스 같은 작고 간단한 유전요소로 옮긴 후 이를 살아있는 생명체에 다시 도입하여 특정 유전자를 순수한 형태로 분리하거나 다양하게 이용을 하는 기술이다.

박테리오파지를 이용한 재조합 DNA 도입. (출처:GettyimagesKorea)

목차

목적 DNA는 관심 있는 생명체의 전체 유전체 DNA가 될 수도 있고, 역전사효소에 의해 RNA 주형으로부터 합성된 DNA, 이미 알려진 DNA주형으로부터 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭된 유전자, 혹은 시험관 내에서 완전히 합성된 DNA일 수도 있다. 여러 방법을 활용하여 목적 DNA를 분리할 수 있다. 만일 크기가 상대적으로 큰 유전체 DNA(Genomic DNA)가 원료라면 조작이 가능한 크기로 만들기 위해 제한효소로 절단하여 조각화(fragmentation)를 한다.

클로닝 벡터는 클로닝된 DNA 조각을 운반하고 복제하는 데 사용되는 작고 독립적으로 복제하는 유전 요소이다. 대부분의 벡터는 플라스미드나 바이러스이다. 클로닝 벡터는 복제에 영향을 주지 않고 절단되는 벡터의 제한 부위에 외부 DNA를 삽입할 수 있도록 디자인되어 있다. 만일 원료 DNA와 벡터가 점착성 말단(sticky end)을 만드는 동일한 제한효소로 절단되면 두 DNA서열의 접합은 점착성 말단의 재결합에 의해 크게 도움이 된다. 일부 제한효소에 의해 만들어지는 평활 말단(blunt end)은 직접 결합하거나 또는 합성 링커(linker)나 어댑터(adaptor)를 이용하여 결합할 수 있다. 어느 경우라도 벡터 DNA와 삽입되는 DNA의 양쪽 가닥을 공유결합으로 연결해주는 효소인 DNA 연결효소(ligase)에 의해 가닥이 연결된다.

벡터와 재조합된 DNA는 복제가 가능한 적절한 숙주 생명체로 도입된다. 형질전환법 (transformation)이 재조합 DNA를 숙주 세포로 넣는 데 흔히 사용된다.

클로닝된 산물을 이용하기 위해 재조합 DNA분자를 보유하고 있는 숙주 세포(클론, Clone)를 확인하는 것이 필요하다. 항생제 내성과 같은 표지를 선별하여 이러한 숙주 세포들만 집락을 형성하도록 하여 원하는 벡터를 가지고 있는 클론을 분리할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용할 때에는 간단히 용균반(plaque)을 찾는다. PCR에 의해 생성되거나 또는 다른 방법에 의해 정제된 단일 DNA단편을 클로닝할 때에는 일반적으로 이러한 단순한 선별과 탐색이면 충분하다. 하지만, 유전자 라이브러리는 수천 또는 수만 개의 클론을 포함하고 있으며, 하나 또는 몇 개의 클론만이 관심있는 유전자를 포함할 수 있다. 이 때 중요한 것은 관심의 대상이 되는 유전자를 보유한 클론을 찾는 일이다. 세균 집락이나 또는 한천배지에서 자라는 바이러스에 감염된 세포의 용균반을 조사해야 하며 관심의 대상이 되는 유전자를 갖고 있는 소수를 탐색해야 한다. 그러나 클로닝된 유전자는 대개 발현되지 않으므로 유일한 방법은 그 DNA 자체를 찾는 것이다. 이때 핵산 혼성화 혹은 보고유전자(reporter gene)를 이용하여 목표 유전자를 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 요즘에는 DNA 서열분석이나 또는 많은 수의 집락에서 추출한 플라스미드로 수행한 제한효소 절단(restriction digest)에 의해 정확한 클론을 찾는다. 이러한 방법은 준 자동화되어 있어 이전보다 노동력이 훨씬 적게 소요된다.

발현 벡터를 활용하여 특정 유전자가 클로닝 숙주에서 발현되면 암호화된 단백질을 스크리닝(screening)할 수 있다. 이를 위해서 숙주 자신은 연구 대상이 되는 단백질을 생산하지 않아야 한다. 암호화된 단백질을 쉽게 검출할 수 있다면 클로닝된 유전자를 포함하는 세포를 선별하는 것은 비교적 간단하다. 관심의 대상이 되는 단백질을 검출하는 데 항체(antibody)를 사용할 수 있다. 항체는 표적 분자인 항원(antigen)에 매우 특이적으로 결합하는 단백질이다. 이 경우, 클로닝된 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 항원이 된다. 각 세포 내에는 매우 적은 양의 항원이 존재하기 때문에 적은 양의 항체만이 결합되므로 결합된 항체를 검출하기 위해서는 고감도의 방법이 사용되어야 할 수도 있다. 실제로 방사성 동위원소, 형광 화합물 또는 효소가 사용된다.

클로닝 과정 모식도. (출처: 김봉수/한림대)

김봉수/한림대학교

이정신/강원대학교

1. Cohen S.N. 2013. DNA cloning: A personal view after 40 years. PNAS. 110(39): 15521-15529.