배양배지

배양배지(국문) culture medium(영문)

미생물을 배양하기 위한 배지를 의미한다. 미생물의 종류에 따라 배양배지의 종류도 달라지게 된다. 배지의 화학적 조성에 따라 한정배지(defined medium)와 복합배지(complex medium)로 구분되고, 특정 미생물을 진단하기 위한 방법으로 감별배지(differential medium)와 강화배지(enrichment medium)가 존재한다.

목차

복합배지는 미생물의 성장에 필요한 다양한 영양물질의 혼합체가 포함된 배지로 정확한 조정을 알 수 없다. 효모(yeast), 쇠고기, 콩, 우유의 카제인 등의 물질을 섞어서 미생물이 성장하는데 필요한 영양소를 공급해주는 배지이다. 복합배지에서는 아주 다양한 물질이 탄소원과 질소원으로 이용될 수 있다. 복합배지는 대략적인 성분을 분석할 수는 있지만 정확한 배지 조성을 알기는 어렵다는 단점이 있다.

LB 배지(Lysogeny broth medium; LB medium)

1951년 Giuseppe Bertani (1923-2015)에 의해 처음 제안된 배지로 이후 대장균(Escherichia coli)을 포함한 많은 종류의 미생물의 성장에 이용되고 있는 배지이다¹⁾. 물 1 L에 트립톤(tryptone)²⁾ (10 g), 효모추출물(yeast extract)³⁾ (5 g), NaCl (10 g)이 들어간 배지이다.

해양미생물 배지(Marine broth medium)

해양에 살고 있는 미생물을 동정하기 위한 배지로 LB 배지에 비해 소금(NaCl)의 농도가 약 2배 (19.4 g/L) 높다. 그 외 철과 마그네슘을 포함한 다양한 이온이 첨가되어 있는 배지이다. 해양에 사는 많은 미생물은 소금의 농도가 일정 이하로 떨어지면 성장하지 못하는 경우가 많아 해양미생물 배지는 해양 미생물 동정에 사용된다.

영양배지(Nutrient broth medium)

펩톤(Peptone)⁴⁾ (5 g/L), NaCl (5 g/L), 효모추출물 (2 g/L), 쇠고기추출물 (1 g/L)로 이루어진 배지로 LB 배지와 함께 다양한 미생물 배양에 사용되는 배지이다. LB 배지와는 달리 쇠고기추출물와 펩톤이 첨가된 것이 차이가 있다. 배지의 조성은 판매 회사에 따라 조금씩 달라지기도 한다.

그 외 NA medium, PYG medium, TSA medium, PYEM medium, R2YE medium 등 다양한 배지가 존재한다.

한정배지는 정량적, 정성적으로 정확한 조성을 알 수 있는 배지이다. 한정배지에는 특정한 탄소원, 질소원 등을 사용할 수 있으므로 특정 영영소가 미생물의 성장에 미치는 영향을 분석할 수 있다.

M9 minimal medium

물 1 L에 Na₂HPO₄-7H₂O (12.8 g), KH₂PO₄ (3 g), NaCl (0.5 g), NH₄Cl (1 g), 2 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 0.4% 포도당(glucose)이 첨가된 배지로 탄소원으로 포도당을 질소원으로 암모니아를 사용한 경우를 예로 들어 제시하였다. 탄소원과 질소원은 실험에 맞게 조절할 수 있다. 배지의 pH도 상황에 따라 다양하게 변화시킬 수 있고, 다른 무기염의 농도도 조절할 수 있다.

Leuconostoc mesenteroides용 한정배지

물 1 L에 K₂HPO₄ (0.6 g), KH₂PO₄ (0.6 g), NH₄Cl (3 g), MgSO₄ (0.1 g), 포도당 (25 g), sodium acetate (20 g), 아미노산들 (alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, 각각 100~200 ug), 퓨린과 피리미딘 (adenine, guanine, uracil, xanthine, 각각 10 mg), 비타민 (biotin, folic acid, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, pantothenic acid, para-aminobenzoic acid, 각각 0.01~1 mg)을 첨가한 배지이다. 많은 생체내 물질을 합성하지 못하는 Leuconostoc mesenteroides의 강한 영양요구성 때문에 다양한 아미노산, 핵산, 비타민이 첨가된 한정배지의 예이다.

강화배지는 몇몇 미생물의 성장을 저해하는 합성물을 넣거나, 특정 미생물의 성장에 유리한 조건을 만들어 주어 특정 세균만 선택적으로 자랄 수 있도록 고안된 배지를 말한다. 이에 비해 감별배지는 생장과정에서 일어나는 특별한 효소반응을 확인할 수 있는 염색약을 이용하는 방법으로, 이 배지에서는 다양한 미생물이 자랄 수 있지만 특별한 효소반응을 수행하는 미생물만이 효소반응을 통해 염색되어 감별할 수 있는 배지이다.

Eosin Methylene Blue(EMB) 배지

물 1 L에 젤라틴 분해물 (10 g), K₂HPO₄ (2 g), 젖당 (10 g), 에오신 Y(eosin Y) (0.4 g), 메틸렌블루(methylene blue) (0.065 g)가 첨가된 배지로 대장균군(coliform bacteria)을 선택적으로 진단하기 위한 강화배지이면서 동시에 감별배지이다. 에오신 Y와 메틸렌블루는 그람양성균(Gram-positive bacteria)의 성장을 저해하여 그람음성균(Gram-negative bacteria)만을 선백적으로 자라게 하는 강화배지이다. 젖당(lactose)을 발효할 수 있는 세균은 배지의 pH를 낮춤으로 에오신 Y의 색변화로 짙은 보라색을 나타낸다. 그람음성균 중 Escherichia, Citrobacter, Enterobacter 등 몇몇 대장균군만 젖당을 발효하므로 대장균군만 짙은 붉은색을 띤다(그림 1). 그러므로 EMB 배지는 대장균군을 진단하는데 오랫동안 사용되었던 배지이다.

Mannitol-salt 배지

카제인 분해산물 (5 g/L), 동물세포 분해산물(5 g/L), 쇠고기추출물 (1 g/L), 만니톨(mannitol) (10 g/L), NaCl (75 g/L), 페놀레드(phenol red) (0.025 g/L)로 이루어진 복합배지로 높은 농도의 소금 (75 g/L)을 가진 배지이다. 이런 고농도의 소금 농도에서 성장할 수 있는 세균은 그람음성균의 Staphylococcus 또는 Micrococcaceae을 제외하고는 거의 없다. 그러므로 Staphylococcus 또는 Micrococcaceae에 대한 강화배지이다. 이 배지에는 만니톨이 들어 있어 만니톨을 발효할 수 있는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)만 콜로니 주위가 노란색으로 염색된다. 그 이유는 만나톨을 발효하여 나오는 산에 의해 배지의 pH가 낮아져 페놀레드가 노란색을 띠기 때문이다(그림 2). 그러므로 이 배지는 황색포도상구균에 대한 감별배지이다. Mannitol-salt 배지는 의학적으로 중요한 황색포도상구균을 동정하는데 사용하는 배지이다.

HE (Hektoen Enteric) 배지

고농도의 담즙염(bile salt) (9 g/L), 싸이오황산나트륨(sodium thiosulfate), 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate), 젖당, 설탕(saccharose), 살리신(salicin), 브롬티몰 블루(bromthymol blue), 산성푹신산(acid fuchsin) 등이 첨가된 복합배지이다⁵⁾. 고농도의 담즙염은 대부분의 그람양성균과 대장균군의 성장을 억제하는 강화배지의 역할을 한다. Salmonella는 배지에 존재하는 싸이오황산을 환원하여 H₂S를 만들 수 있다. H₂S는 배지에 존재하는 구연산 철 암모늄과와 반응하여 검은색의 FeS 침전물을 형성할 수 있다. Proteus sp.와 Citrobacter freundii 등의 몇몇 세균도 H₂S를 생성할 수 있는데, 이들은 담즙염에 민감한 편으로 잘 자라지 못한다. 혹시나 자라는 경우에도 이들은 배지에 존재하는 젖당, 설탕, 살리신 중 적어도 하나의 탄수화물을 발효할 수 있다. 이들 탄수화물을 발효하면 pH 지시약인 브롬티몰 블루, 산성푹신산에 의해 콜로니 주위가 노란색을 띠게 된다. 그러므로 HE 배지는 Salmonella에 대한 감별배지로 작용한다. 본 배지에서 대장균근은 자라지 못하거나 자라더라도 노란색을 띤다. Proteus sp.와 Citrobacter freundii 세균들은 노란색 배경을 가진 작은 검은 콜로니를 형성한다. Salmonella는 노란색 배경이 없는 큰 검은색 콜로니를 형성하게 된다. 그러므로 HE 배지는 주요한 식중균인 Salmonella를 진단하기 위한 배지이다. Hektoen이라는 이름은 이 배지를 발명한 시카고의 Hektoen Institute 이름에서 유래하였다.

혈액한천배지(Blood agar medium)

5–10%의 적혈구가 포함된 배지로 용혈 능력(hemolytic activity)을 가진 세균을 동정하기 위한 감별배지이다. 세포막에 구멍을 뚫는 용혈소(hemolysin)라는 독소를 분비하는 세균들은 배지에 존재하는 적혈구를 파괴하는 능력을 나타내기도 한다. 적혈구 용혈 능력에 따라 용혈소는 세 가지 타입이 나눌 수 있다. 알파 타입은 용혈소가 적혈구를 분해하면서 노출된 헤모글로빈(hemoglobin)의 철이 산화하여 메트헤모글로빈(methemoglobin)이 되면서 콜로니 색이 녹색을 띠게 된다(그림 3)⁶⁾. 베타 타입은 적혈구를 완전히 분해하면서 콜로니 주위가 노란색 또은 투명한 환을 형성하게 된다. 감마 타입은 용혈 능력을 보이지 않아 콜로니에 변화가 없다⁷⁾.

효모(yeast), 대장균(Escherichia coli), 대장균군(coliform bacteria), 그람양성균(Gram-positive bacteria), 그람음성균(Gram-negative bacteria), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

이창로/명지대학교

하남출/서울대학교

1. Bertani G. 1951. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J. Bacteriol. 62, 293–300.
2. 우유 단백질인 카제인을 소화효소인 트립신으로 분해한 물질
3. 효모를 분쇄한 후, 세포벽 분획을 제거한 물질
4. 우유 단백질인 카제인을 소호효소인 펩신으로 자른 물질.
5. Goo VY, Ching GQ, Gooch JM. 1973. Comparison of brilliant green agar and Hektoen enteric agar media in the isolation of salmonellae from food products. Appl Microbiol. 26, 288–92.
6. Maheswaran SK, Lindorfer RK. 1967. Staphylococcal beta-hemolysin. II. Phospholipase C activity of purified ß-hemolysin. J. Bacteriol. 94, 1313–9.
7. Dalla Serra M, Coraiola M, Viero G, Comai M, Potrich C, Ferreras M, Baba-Moussa L, Colin DA, Menestrina G, Bhakdi S, Prévost G. 2005. Staphylococcus aureus bicomponent gamma-hemolysins, HlgA, HlgB, and HlgC, can form mixed pores containing all components. J Chem Inf Model. 45, 1539–45.