효소 면역 측정법

[ ELISA ]

효소 면역 측정법은 항체-항원 반응을 이용하여 시료에 존재하는 물질(일반적으로 단백질)의 양과 항원-항체 반응 강도를 정량적으로 측정할 수 있는 방법이다. 일반적으로 시료의 항원을 마이크로플레이트(microplate) 표면에 부착시킨 후, 항원에 결합할 수 있는 항체를 결합시키게 되는데, 이때 항체에 특정 효소를 결합시켜 기질-효소 반응에 의한 색깔 변화가 나타내게 되어 이를 마이크로플레이트 분광광도계를 통해 정량적으로 계산할 수 있다.

효소 면역 측정법 (제작: 김근필/중앙대)

효소 면역 측정법이 개발되기 전에는 동위원소가 표지 된 항원 혹은 항체를 사용하였고 이는 1960년 'The Journal of Clinical Investigation' 논문에 Rosalyn Sussman Yalow와 Solomon Berson에 의해 처음 소개되었다. 하지만, 동위원소를 사용한 방법은 연구자의 건강에 해로울 수 있는 문제가 있어 새로운 검출 방법을 개발하기 위한 필요성이 생기게 되었다. 결국 이를 위해 효소와 기질 반응을 통해 색의 변화를 활용하고자 하는 노력을 꾸준히 하게 되었고, 현재 사용되고 있는 효소 면역 측정법을 이용한 색 변화 관찰 방법은 1971년 스웨덴 스톡홀름 대학의 Peter Perlmann와 Eva Engvall에 의해 'Immunochemistry' 논문에 게재되었다¹⁾. 더불어 같은 해에 네덜란드에서 Anton Schuurs와 Bauke van Weemen의 결과는 'FEBS Letters' 논문에 게재되었다²⁾.

효소 면역 측정법의 원리

효소 면역 측정법(ELISA)은 빠른 시간 안에 다양한 시료에 들어 있는 특정 단백질에 대한 항체-항원 간의 상호작용을 검증할 수 있으며, 이를 위해 여러 가지 시료를 검출 할 수 있는 96-well 마이크로플레이트에서 실시할 수 있다. 그 과정을 살펴보면 1차 항체를 96-well 마이크로플레이트의 표면에 결합시킨 후, 표면과 약한 결합을 이루는 항체를 완충용액으로 씻어 제거한다. 이렇게 항체를 표면에 고정 시킨 후, 원하는 다양한 시료 혼합물을 각 96-well 마이크로플레이트 홈에 넣어 항원-항체 간의 특이적 결합이 일어 날 수 있도록 일정 시간 동안 기다린다. 마찬가지로 비특이적 결합을 이룬 항원-항체 결합을 제거하기 위해 단백질 완충용액으로 씻어 낸 후, 2차 항체를 넣어 역시 항원-항체 반응이 일어 날 수 있도록 한다. 이러한 항원-항체 반응이 이루어진 각 시료에 대해 단백질 완충용액으로 비특이적 결합을 이룬 항체를 제거 한 후, alkaline phosphatase나 horse radish peroxidase 효소가 결합되어 있는 항체를 넣어 항체-항체의 결합이 이루어 질 수 있도록 기다린다. 마지막으로 단백질 완충용액으로 결합되지 않은 항체를 씻어 낸 후, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 같은 종류의 기질을 넣어 효소와의 반응을 통해 색 변화가 있는 well을 마이크로플레이트 분광광도계를 통해 정량 한다. 이러한 과정을 샌드위치법이라 하며, 처음 항체를 표면에 안정화 시킨 후 항원과의 결합을 유도하는 과정이 직접법이나 간접법과는 다르다.

효소 면역 측정법 과정 (제작: 김근필/중앙대)

효소 면역 측정법의 종류

직접법(Direct Assay)

항원을 표면에 결합 시킨 후, 색 반응을 나타내는 효소가 결합된 1차 항체를 넣어 항원-항체 결합을 이룬다. 기질을 추가하여 색 반응을 정량 한다.

간접법(Indirect Assay)

직접법과 같이 항원을 표면에 결합 시키지만, 항원과 결합하는 1차 항체에 효소를 결합시키지 않고, 2차 항체에 결합된 효소를 통해 기질과의 색 반응을 정량 한다.

샌드위치법(Sandwich Assay)

특정 항원에 대한 항체를 표면에 앞서 결합시키고, 실험하고자 하는 항원을 결합시킨 다음, 2차 항체와 효소가 결합되어 있는 3차 항체를 결합시킨다. 역시 효소에 대한 기질을 넣어 색 반응을 정량 한다. 샌드위치법은 항원이 적거나 예측되지 않은 항원을 검출하고자 할 때 사용된다.

효소 면역 측정법의 종류 (그림: 서창완/서울대)

효소 면역 측정법에 사용하는 효소 표지자

OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride)

TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)

ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)

PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt)

적용분야

의료분야에서의 효소 면역 측정법은 시료에 항체 혹은 항원이 존재할 때 측정이 가능하며 이로 인해 다양한 바이러스 및 병원성 세균에 대한 항원-항체 반응을 정량 할 때 유용하다. 또한, 식품산업 분야에서 우유, 땅콩, 아몬드, 달걀 등의 알레르기 유발 물질에 대한 시험을 위해 사용될 수 있다. 특히 최근에는 높은 민감도의 HIV 바이러스 테스트를 통한 에이즈의 진단에도 사용이 되며 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염의 진단과 암의 진단에도 사용되어 오고 있다. 따라서, 효소 면역 측정법은 진단 의학, 식품산업, 그리고 백신 개발 등 다양한 분야에 사용이 가능하다. 아래 표는 현재 상용화된 표적 항원에 대한 효소 면역 측정 Kit의 종류이다³⁾.


표적 항원	이용 방식	표지 인자	적용분야
Interferon gamma	샌드위치법	Streptavidin-HRP	치료 표지 인자
Interleukin-2	샌드위치법	HRP-결합된 항체	치료 표지 인자
Human Immunodeficiency Virus	샌드위치법	HRP-결합된 항체	에이즈 표지 인자
Prostate Specific Antigen	샌드위치법	HRP-결합된 항체	전립선암 표지 인자
Alpha Fetoprotein	샌드위치법	HRP-결합된 항체	간암 표지 인자
Hepatitis B Surface Antigen	샌드위치법	HRP-결합된 항체	B형 간염 표지 인자

집필

김근필/중앙대학교

감수

최경희/원광대학교

참고문헌

1. Engvall, E. and Perlmann, P. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871–874.
2. Van Weemen, B.K. and Schuurs, A.H.W.M. 1971. Immunoassay using antigen—enzyme conjugates. FEBS Lett. 15, 232–236.
3. 정유진, 이영미, 정산전. 2007. 면역분석에 기초한 바이오센서 기술. 한국바이오칩학회 특별기고 pp. 3-7.

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