흡광도

분광학에서 어떤 화학종에 특정 파장을 가진 복사선을 조사하였을 때 특정 화학종이 그 복사선을 얼마나 잘 흡수하는지 정도를 나타내는 척도인 흡광도(absorbance)는 광학 밀도(optical density)로도 불린다.^1-2

목차

양자론에 따르면 모든 기본 입자(원자, 이온 또는 분자)는 특정한 일련의 불연속적으로 양자화된 에너지 준위를 가지며, 이 중에서 가장 낮은 에너지 상태를 바닥 상태(ground state), 하나 또는 그 이상의 높은 에너지 상태를 들뜬 상태(excited state)라 한다. 실온에서 대부분의 기본 입자는 바닥 상태로 존재한다.

그림 1에서 보듯이 특정한 파장을 가진 빛이 기본 입자에 조사되면 입자는 복사선 광자(photon)의 에너지를 흡수(absorption)하여 바닥 상태에서 들뜬 상태로 전이(transition)되는데, 이때 복사선의 광자 에너지는 기본 입자의 바닥과 들뜬 상태의 에너지 차이와 정확하게 일치되어야 한다. 이러한 에너지 차이는 화학종마다 고유한 값을 가지므로 흡수된 복사선의 파장을 확인하면 시료의 화학종을 특정하는 정성 분석을 할 수 있다. 또한 시료의 특정 화학종에 의하여 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다르므로 빛의 흡수 정도를 측정하면 화학 물질의 양을 결정할 수 있다.

그림 1. 빛의 흡수(absorption)와 방출(emission) ()

물질의 흡수 특성은 복사선의 파장, 진동수 및 파수에 따른 흡수 정도의 상관관계를 도시한 흡수 스펙트럼(absorption spectrum)으로 나타낸다. 이때 복사선의 흡수 정도를 나타내는 용어로 흡광도(absorbance)와 투과도(transmittance)를 사용한다. 그림 2는 광합성의 핵심 분자로 빛에너지를 흡수하는 안테나 역할을 하는 색소인 엽록소, 클로로필의 가시광선(visible radiation) 영역에서 얻은 흡수 스펙트럼(흡광도 vs 파장)을 보여준다.

그림 2. 엽록소의 가시광 흡수 스펙트럼(흡광도 vs 파장) ()

단색광이 어떤 용액을 통과할 때, 투과광의 세기(I)와 입사광 세기(I₀)의 비율을 투과도(transmittance, T)라 하고, 투과도의 역수의 상용대수를 흡광도(absorbance, A)라 한다.

그림 3은 시료의 농도가 C이고 두께가 l인 매질을 통과하기 전과 후의 특정한 파장 @@NAMATH_INLINE@@\lambda@@NAMATH_INLINE@@를 가진 단색광(momochromatic light)의 평행한 복사선을 보여준다. 시료가 특정 파장의 빛을 흡수하게 되면, 빛의 세기(intensity, I)는 Io 로 부터 I 로 변하게 된다. 단색광의 일부는 시료에 의해 흡수되었기 때문에, 투과도 T 는 다음과 같은 복사선 세기의 분율로 정의된다.

T = I /Io

따라서 투과도 T 는 0~1 사이의 값을 가지게 된다.

또한 투과도는 %로 나타내기도 한다.

%T = I /Io x 100%

따라서 투과도%는 0~100% 사이의 값을 가진다.

흡광도 A 는 다음과 같이 정의된다.

A = -logT = log(Io/I)

만약 빛이 시료에 의해 전혀 흡수되지 않았다면 Io 는 I 와 같으므로 T = 1이고 흡광도 A = 0이다. 만약 90%의 빛이 시료에 의해 흡수되었다면 10% 빛이 투과되었으므로 I = Io/10가 되어 흡광도 A = 1 이 된다. 만약 단지 1%의 빛이 투과되고 99%의 빛이 흡수되었다면 A = 2가 된다.

그림 3. 시료에 의한 단색광 빛의 흡수 ()

흡광도는 화학뿐만이 아니라 다양한 과학 분야에서 매우 중요한 역할을 하는데, 이는 흡광도가 시료에서 빛을 흡수하는 화학종의 농도에 직접적으로 비례하기 떄문이다. 이러한 관계를 식은 아래와 같다.

A = @@NAMATH_INLINE@@\varepsilon@@NAMATH_INLINE@@bc

즉 흡광도 A는 입사시킨 특정 파장의 단색광을 흡수하는 화학종의 몰농도 C, 단색광이 지나가는 경로의 길이 l, 그리고 그 화학종의 특정 파장에 대한 몰흡광 계수(molar absorptivity, @@NAMATH_INLINE@@\varepsilon@@NAMATH_INLINE@@)에 비례한다. 위의 수식에서 단색광의 경로 길이는 주로 cm 단위를 사용하며, 시료의 농도는 몰농도(M)를 사용한다. 몰흡광 계수 혹은 소광 계수(extinction coefficient)는 시료의 고유한 특성으로 그 단위는 M^-1cm^-1이다. 결과적으로 흡광도는 단위가 없지만, 흔히 흡광도 단위(absorbance unit)를 사용하기도 한다.

비어(A. Beer)는 시료의 흡광도는 시료에서 빛을 흡수하는 화학종의 농도에 비례함을 밝혔고, 람베르트(J. H. Lambert)는 시료의 흡광도는 시료의 두께에 비례함을 보였다. 따라서 Beer-Lambert 법칙은 위의 두 가지 내용을 합쳐서 기술한 것이며, 이는 분광 광도법(spectrophotometry)의 기본 법칙 중의 하나이다.

Beer-Lambert 법칙에는 두 가지 가정이 있다.

첫째, 발색단, 즉 빛을 흡수하는 분자들은 서로 다른 분자들에 영향을 미치지 않는다. 즉 용액이 이상용액이다.

둘째, 용액 속에 있는 모든 분자는 동일하게 광자를 흡수할 수 있다.

그러나 이러한 가정은 용액의 농도가 높아지면 즉 분자 간의 거리가 가까워지면 분자들이 서로 영향을 미쳐서 몰흡광 계수가 변화하게 되므로 실제로 측정되어야 하는 흡광도에 비해 낮게 측정될 수밖에 없다. 따라서 Beer 법칙은 매우 좁은 파장의 범위를 가지는 단색광의 빛에 적용할 수 있다. 또한 대부분의 화학종에 대하여 묽은 용액(0.01 M 이하)에서 잘 적용되지만, 농도가 매우 높은 경우 잘 적용되지 않는다. 분광 광도법을 활용하기 위한 용액의 적정 농도는 측정에서 얻은 흡광도가 0.1~1.0(더 바람직하게는 0.2～0.7)의 범위가 되도록 하는 것이 바람직하다. 용액의 흡광도가 이보다 높을 때는 적당한 농도가 되도록 용매로 희석한 다음 측정한다. 그림 4에서 보듯이 용액의 농도에 따른 흡광도 검정 곡선은 저농도 영역에서는 직선성을 보여주지만, 고농도 영역에서는 이에서 벗어난다.

그림 4. 용액의 농도에 따른 흡광도의 검정 곡선 (고농도 영역에서는 직선성으로부터 벗어난다) (출처: 대한화학회)

흡광법은 주로 자외선(ultraviolet, 180~320nm) 및 가시광선 (visible, 320~800nm) 영역의 빛을 이용한다. 적외선(infrared radiation) 흡수 분광법은 분자의 작용기에 대한 특징적인 스펙트럼을 비교적 쉽게 얻을 수 있으며, 광학이성질체를 제외한 모든 물질의 스펙트럼이 다르므로 분자의 화학적 구조를 확인하는데 필요한 정보를 제공하여 준다. 따라서 적외선 흡수 분광법은 무기 및 유기화학은 물론 모든 화학 분야에서 널리 사용되고 있다. 자외선·가시광선(UV-VIS) 흡수 분광법은 화학종의 정량에 주로 사용된다. 생명과학 분야에서 사용하는 대표적인 예는 다음과 같다.

DNA의 염기는 아데닌(A)과 구아닌(G)이 속해 있는 푸린 염기와 시토신(C)과 티민(T)이 있는 피리미딘 염기로 이루어져 있는데, 미국인 생화학자 샤가프(Erwin Chargaff)는 여러 가지 생물의 여러 조직으로부터 DNA를 추출한 다음 알칼리로 가수분해해서 4가지 염기를 얻고, 종이 크로마토그래피로 분리한 다음 각 염기에 해당하는 부분을 산성 용액으로 추출하고 흡광도를 측정하여 정량분석하여 이중 A와 T의 양이 같고 C와 G의 양이 같다는 '샤가프의 법칙(Chargaff’s rules)'을 도출했다. 이 법칙은 후에 왓슨(J. D. Watson)과 크릭(F. H. C. Crick)이 2중 나선 DNA 구조의 모델을 만드는 데 크게 기여하였다.³

기체 크로마토그래피(GC)와 달리 고분해능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 혹은 모세관 전기이동(capillary electrophoresis, CE)에서는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector, FID) 및 열전도도 검출기(thermal conductivity detector)와 같이 대부분의 시료를 고감도로 검출할 수 있는 유니버설 검출기(universal detector)가 존재하지 않는다. HPLC와 CE가 발전하는 데 있어서 가장 중요한 도전적 단계가 바로 검출기를 개발하는 일이다. HPLC 칼럼 혹은 CE의 모세관을 통해 분리된 화학종을 검출하기 위해서 다양한 검출기가 활용되고 있다. 그중에서도 가장 널리 활용되는 검출기는 UV-VIS 흡광도 검출기로 실제 사용하는 전체 검출기의 70%를 차지한다. UV-VIS 흡광도 검출기는 이중 결합, 삼중 결합, 방향족 화합물 등의 불포화 결합을 갖는 물질의 분석에 적합하다.

칼럼이나 모세관으로부터 분리된 화학종이 검출기의 측정 셀(cell) 내로 이동한 후 이 화학종에 광원으로부터 선택된 특정한 파장의 빛을 조사하여 각 화학종이 흡수하는 빛의 양으로부터 각 성분의 농도를 측정하게 된다.

그림 5는 HPLC에 활용되는 UV-VIS 흡광도 검출기의 모식도를 보여준다. 검출기의 셀(녹색 U 자 모양)은 전형적으로 1~10μL이며, 흡광도를 향상하기 위해서는 빛이 지나가는 경로가 길어야 하므로 셀의 길이를 2~10mm 정도로 확장해 사용한다. 모세관 전기이동의 경우, 모세관상(on-column)에서 시료를 검출하게 되는데 모세관의 지름이 매우 작아 흡광도 측정을 위한 빛의 통과 길이가 단지 50~100μm 정도밖에 되지 않음으로 농도로 나타내는 검출 한계는 좋지 못하지만 다루는 시료의 부피가 nL 정도로 매우 적어 질량 검출 한계는 HPLC의 것과 같거나 더 좋다. 흡광도 측정의 감도를 향상하기 위하여, 빛이 통과하는 거리를 증가시키기 위해 다중 반사 등의 여러 가지 방법이 고안되고 있다.

그림 5. HPLC에 활용되는 UV-VIS 흡광도 검출기 ()

HPLC와 UV-VIS 흡광도 검출기를 활용한 시스템은 바이오 분석, 약품 분석, 식품 분석, 환경 분석, 법의학 등 다양한 분야에 널리 활용된다. 그림 6은 HPLC-UV-VIS 흡광도 검출기를 활용한 에너지 음료의 성분 분석을 시행한 예를 보여준다.

그림 6. HPLC-UV-VIS 흡광도 검출기를 활용한 에너지 음료의 성분 분석 ()