젤 여과

젤 여과(한글) gel filtration(영어)

젤 여과 크로마토그래피 (size-exclusion chormatography, molecular sieve chromatography)는 수용액속의 분자를 분자들의 크기나 분자량에 따라 분리하는 크로마토그래피의 한 방법이다.

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젤 여과 크로마토그래피법은 그란트 핸리 라테헤 (Grant Henry Latthe) 와 콜린 루쓰븐 (Colin R Ruthven) 이 런던의 퀸샤롯 (Queen Charlotte) 병원에서 일할때 발견하였다.

젤 여과 크로마토그래피는 단백질이나 폴리머를 분석하는 방법으로 작은 분자들이 크로마토그래피 레진(resin)에 의해 컬럼을 지나는 속도가 늦어지게 된다. 크로마토그래피 레진은 작은 구멍이 많이 있는 구슬같은 모양으로 되어 있는데, 작은 분자들은 이러한 구슬의 구멍속을 통과해 지나가게 되고, 큰 분자들은 구슬의 구멍으로 들어가지 못하고 구슬과 구슬사이의 공간을 지나가게 된다. 따라서, 수용액속의 분자들이 컬럼을 지나가는동안, 큰 분자들에 비해 작은 분자들이 훨씬 지나는 길 (path)가 길어지게 되어, 큰분자들이 크로마토그래피에서 먼저 용출되고, 작은 분자들은 나중에 용출된다. 이러한 원리로 분자량이나 크기에 따라 분리할 수 있다. 하지만 분자들은 용액속에서 회전을 하기 때문에, 단순한 분자량보다는 분자들의 생긴 모양에 따라, 젤 여과 크로마토그래피에서 용출되는 위치가 차이가 날 수 있다. 작은 분자들이 모든 구슬의 구명을 통해 나올경우 전체 컬럼 부피의 85%위치에서 용출되게되고, 큰 분자들이 구슬의 구멍에 들어가지 않고 구슬과 구슬사이의 공간을 통해서 나올경우는 전체 컬럼 부피의 35% 위치에서 용출되게 된다. 약 100ml 부피의 레진의 크로마토그레피의 경의 매우 큰 분자는 35ml 위치에서 용출되게 되고, 아주 작은 분자는 85ml 위치에서 용출되게 된다 (그림 1). 이경우 컬럼 전체 부피를 '컬럼 부피, column volume' 이라고 하고, 이 컬럼부피의 35%에 해당하는 부피를 '공백 부피, Void volume' 이라고 한다.

젤 여과 크로마토그레피를 이용하여 분석할 경우, 크로마토그래피에서 분출되는 용액을 시간에 따라 일정량으로 분주(fraction)한다. 각 분주된 용액속에는 크기가 유사한 분자들이 들어있게 된다. 분주된 용액속의 크기를 파악하기 위해서는, 이미 알려진 크기의 표준 분자를 젤 여과 크로마토그레피로 분석하여 용출되는 분주 위치와 비교분석한다. 또한 분주된 용액의 크기를 정확히 분석하기 위해서는 크로마토그래피에서 분출되는 분자들은 다양한 분광기법 (예, Multi-Angle Laser Light Scattering)을 이용하여 정확한 분자의 크기를 측정한다.

그림 1. 젤 여과 크로마토그리피의 원리 (그림 출처: 위키피디아)

분자들은 용액속에서 고정된 모양을 가지지 않고 다양한 모양을 취할 수 있다. 따라서 젤 여과 크로마토그레피의 레진 구슬의 구멍에 들어가는 확율은 분자들이 용액속에서 취하는 모양의 분포에 따라 결정된다.

젤 여과 크로마토그래피는 분자들이 지나는 길 (path) 즉 분자들이 컬럼을 통과하는 시간차를 이용해서 분리하는 방법으로 컬럼의 길이에 따라 분리할 수 있는 해상도가 바뀐다. 컬럼의 폭을 늘리면 분석할 수 있는 샘플의 양은 증가하고, 컬럼의 길이를 늘리면 해상도가 높아진다. 따라서 컬럼의 폭과 길이의 비율이 분석할 수 있는 샘플의 양과 해상도를 결정한다. 또한 크로마토그래피를 이루는 레진의 분자들간의 상호작용이 있을 경우, 정확한 분리가 어렵다. 특히 덱스트란등의 당류로 만든 레진의 경우 이온농도가 낮은 용액으로 분석할 경우 단백질들이 레진과 상호작용하여 용출되는 위치에 영향을 미친다.

젤 여과 크로마토그레피는 분리할 수 있는 해상도가 다른 크로마토그레피에 비해 높지 않기 때문에, 단백질등이 정제의 최종과정에 사용된다. 또한 단백질이 용액속에서 존재하는 다량체 형성 상태를 분석하는데 매우 유용하다. 예를 들어 50 kDa의 단백질을 젤 여과 크로마토그레피법으로 분석하였더니 용출되는 위치가 표준단백질과 비교하였을때 약 200 kDa 의 위치에서 용출된다면 이 단백질은 용액에서 사량체를 형성하는 것으로 유추할 수 있다.

젤 여과 크로마토그레피는 합성한 폴리머 크기의 분포등을 분석하는데 사용한다. 즉 이미 알려진 크기의 폴리머을 젤 여과 크로마토그레피를 통해 표준 용출위치를 측정한후 새로 합성한 폴리머의 용출위치를 비교분석하여 폴리커의 크기를 알 수 있다.