크로마토그래피

크로마토그래피는 다양한 분자들이 섞여 있는 혼합체로부터 이들을 분리하는 실험방법이다.

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크로마토그래피는 이탈리아 태생 러시아 과학자인 미하일 츠베트(Mikhail Tsvet)에 의해 1900년대 사용되었는데, 특히 식물의 다양한 색소를 분리하는 데 처음 사용되었다. 이렇듯 색깔이 있는 식물의 색소를 분리하는 방법으로 소개되어 chromato(색)+graphy라고 이름이 붙여졌다. 그후 1940년대에 크로마토그래피를 이용한 분리법의 이론체계를 확립하게 되어 아쳐 존 포터 마틴(Archer John Porter Martin)과 리처드 로렌스 밀링턴 싱(Richard Laurence Millington Synge)이 1952년 노벨 화학상을 수상하게 되었다. 이들의 이론을 바탕으로 종이, 기체, 액체 등 다양한 매개를 이용한 크로마토그래피법이 개발되었다.

크로마토그래피는 기본적으로 액체, 기체 등의 이동상(mobile phase)과 종이, 합성수지 등으로 이루어진 고정상(stationary phase)로 이루어져 있다. 혼합물이 이동상에 녹은 상태로 고정상을 통과할 때 고정상과 혼합물 사이의 다양한 결합 등에 의해 혼합물을 이루고 있는 물질들의 이동시간이 달라지는 것을 이용하여 각 물질을 분리해낸다. 그림 1에서와같이 혼합물질이 이동상에 녹은 채로 고정상의 처음 부분에 있다가, 이동상이 고정상을 따라서 움직이게 된다. 이때 혼합물질이 이동상을 따라서 고정상 위로 움직이게 되는데, 혼합물속에 존재하는 각 물질의 성질에 따라 그 이동속도가 다르게 되고, 최종적으로 시작점에서 이동거리가 달라진다. 이러한 원리를 이용하여 혼합물속의 물질을 분리하게 된다. 이동상이 기체면 기체 크로마토그래피, 액체면 액체 크로마토그래피로 분류된다.

그림 1. 크로마토그래피의 원리 혼합물 (사각, 원, 삼각)이 이동상(노란색)이 고정상(희색박스)을 따라 이동하게 됨에 따라 혼합물이 분리된다.

이온 교환 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피로, 물질의 전기성을 이용하여 분해하는 방법이다. 고정상이 경우에 따라 음극(negative) 전하를 가진 물질로 되어 있거나, 양극(positive) 전하를 가진 물질로 되어 있다. 이때, 이동상에 녹아있는 단백질 등의 물질이 고정상의 전하와 상호 작용으로 결합하게 되고 이동상과 비슷한 전하를 가진 물질은 결합하지 않게 되고, 고정상과 결합한 물질은 이동상의 (주로 NaCl 등) 이온 농도를 증가시켜 이러한 전기적 상호작용을 상쇄하는 방식으로 물질을 고정상으로부터 떨어져 나가게 하여 분리하는 방식이다. 고정상이 음극전하를 가질 경우 양전하(Cation)를 가진 물질이 붙어 있다가, 이동상의 이온농도가 증가됨에 따라 떨어져 나가게 되는 방식으로 작용하여 양전하 교환 크로마토그래피(Cation exchange chromatography)라고 불린다. 반대로 고정상이 양전하를 가질 경우 음전하(Anion)를 가진 물질이 붙게 되고, 이동상의 이온농도가 증가함에 따라 떨어져 나가게 되는 방식으로 작용하며 이를 음전하 교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography)라고 불린다. 단백질의 경우 그 구성 아미노산에 따라 특정 버퍼에서 양전하 혹은 음전하를 가지는데 이러한 성질을 이용하여 단백질을 순수 정제하는 데 이용된다.

젤 여과 크로마토그래피는 주로 단백질의 크기에 따라 분리하는 크로마토그래피 법이다. 이때 고정상은 구멍이 있는 작은 구슬로 구성되는데, 단백질이 이동상인 버퍼를 통해 고정상을 지나갈 때 크기가 작은 단백질은 구슬의 구멍 안으로 들어가게 되고, 크기가 큰 단백질은 구슬의 구멍안으로 들어가지 못하고 구슬과 구슬의 공간으로 지나가게 되어, 크기가 큰 단백질은 지나가는 경로가 짧게 된다. 따라서 크기가 큰 단백질은 크기가 작은 단백질에 비해 현저히 빠르게 이동한다. 이러한 이동속도의 차이를 이용하여 단백질들을 크기에 따라 분리하는 크로마토그래피 방법이다.

친화성 크로마토그래피는 이동상에 있는 단백질 등이 특정 화합물이나 항체 등에 결합하는 원리를 이용한다. 고정상은 특정 단백질이 특이적으로 결합하는 화학물이나 항체를 가지고 있고, 이동상에서 단백질이 고정상을 지나가면서 결합하게 된다. 예를 들면, 항체를 이용하는 항체 친화성 크로마토그래피 등이 있다. 대부분은 단백질에 특정표지를 달아 이들 표지가 고정상과 특이적으로 결합하는 방식을 이용한다. 단백질 정제에 가장 많이 사용하는 표지로서는 GST, His, FLAG, Biotin 등이 있다.