DNA-DNA 혼성화

DNA-DNA 혼성화(DNA-DNA hybridization; DDH)는 유전체 간 상동성 정도를 측정하는 실험법으로 1961년에 처음 개발되었으며¹⁾ 다른 용어로는 DNA-DNA 잡종화 또는 DNA-DNA reassociation이라고도 한다. 두 개체가 최근에 공통 조상으로부터 진화하였다면 서로 유사한 염기서열을 가지고 있을 것이고, 이 때문에 두 유전체는 혼성화가 잘 일어날 수 있다. 진화적인 유연관계가 높을수록 혼성화가 잘 일어나므로, 혼성화의 정도에 따라 두 개체 간 유전체 수준에서의 진화적인 거리를 간접적으로 계산할 수 있다.

목차

비교하고자 하는 두 개체로부터 DNA를 추출한 뒤 각각 높은 온도로 가열한다. DNA는 이중가닥으로 되어있는데, 이를 용액 상에서 높은 온도로 가열하면 이중가닥을 만들어주는 염기 사이의 상보적 수소결합이 끊어지면서 두 개의 단일가닥으로 분리되며 이를 변성(denaturation)이라 한다. 이렇게 변성된 단일가닥의 DNA는 온도를 낮추어주면 다시 상보적인 염기서열을 찾아 이중가닥을 형성하게 되는데 이를 재결합(renaturation, reassociation)이라 한다. 재결합 시에는 염기서열이 유사한 구간일수록 염기 사이에 견고한 결합을 이루고, 반대로 염기서열에 차이가 많이 나는 구간은 서로 잘 붙지 않는다. 따라서 개체 A의 단일가닥 DNA에 동일한 개체 A의 단일가닥 DNA를 섞어서 온도를 낮추면 대부분의 DNA가 상보적인 제 짝을 찾아 재결합하여 이중가닥으로 바뀐다. 그런데 개체 A의 DNA에 개체 B의 DNA를 섞어서 재결합 반응을 시키면 두 개체의 DNA 사이에 혼성화가 일어나고 이때 유전체 염기서열 간 유사도에 따라 혼성화 결합 비율이 달라진다. 두 균주의 염기서열이 유사할수록 혼성화율이 높아지고, 차이가 다소 나는 균주간에는 혼성화율이 낮아지며, 아주 많이 다른 균주라면 아예 DNA 혼성화가 일어나지 않는다. A의 DNA가 스스로 재결합하는 비율을 100%라고 할 때, A와 B를 혼합했을 때 두 DNA가 결합하는 상대적인 비율을 혼성화율이라고 한다.

혼성화 결합율을 측정하는 방법에는 아래와 같이 여러 방법이 있다. 크게는 용액 상태에서 DNA 혼성화를 일으키는 것과 고체 표면에 주형을 부착한 뒤에 DNA 혼성화를 일으키는 두가지 방법으로 나뉘는데, 더 세분화 하자면 DNA를 표지하는 방법과 혼성화율을 측정하는 기술적 방법에 따라 다음과 같은 범주로 나뉠 수 있다. 최근에 전장유전체 염기서열로부터 혼성화율을 생물정보학 기반 가상실험(in-silico)으로 계산하는 방법이 등장하여 널리 쓰이고 있다.

한쪽 균주의 DNA를 나일론 막에 고정시키고 여기에 비교하고자 하는 균주의 DNA를 결합시켜서 혼성화가 일어나는 정도를 정량적으로 측정한다. 이때 probe DNA를 표지하여 이중가닥을 이룬 양만큼 신호가 커지는 것을 측정한다. 예전에는 이를 측정하기 위해 방사성 동위원소로 표지를 하였으나²⁾ 요즘은 비방사능 동위원소를³⁾ 많이 사용한다.

멤브레인 고정법 실험 개요 (출처: 한국미생물학회)

마이크로플레이트법은 막 고정법의 변형인데, DNA를 막에 붙이지 않고 대신 마이크로플레이트 웰의 바닥에 붙인 상태에서 혼성화 반응을 수행한다. DNA는 photobiotin으로 표지하기도 하고 ⁴⁾, digoxigenin으로 표지하기도 한다⁵⁾. 이 방법의 장점은 막 고정법에 비해 DNA양이 적어도 실험이 가능하다는 점이다.

이중가닥 DNA와 단일가닥 DNA가 260nm 파장의 빛을 흡수하는 흡광도가 다르다는 것에 착안하여 분광광도계를 사용하여 혼성화율을 측정하는 것이다 ⁶⁾. 비교하려는 두 가지 DNA를 모두 한 용액상에서 섞은 후 온도를 올려 변성시키고, 온도를 서서히 내려주면서 혼성화가 시작되는데, 이때 균주 간 DNA 염기서열의 유사도가 높을수록 빨리 혼성화 결합이 완료되고 반대로 멀수록 혼성화 속도는 느려진다.

하이드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography)법은¹⁾⁷⁾ DNA-DNA 혼성화법이 최초로 개발되던 시기에 사용한 실험법으로 요즘에는 잘 쓰지 않는 방법이다. 낮은 농도의 인산염 용액에서 단일가닥 DNA에 비해 이중가닥 DNA만 선택적으로 하이드록실아파타이트에 부착하는 원리에 바탕을 둔 방법이다.

S1 뉴클레아제법⁸⁾ 역시 요즘에는 잘 쓰지 않는 방법인데, 핵산 가수분해효소인 endonuclease의 한 종류인 S1 뉴클레아제가 단일가닥 DNA만 선택적으로 분해한다는 특징에 기반하여 재결합 후 효소처리를 하여 남은 이중가닥 DNA 양을 측정함으로써 혼성화 결합 비율을 추정하는 방법이다.

위에 열거한 방법들은 비교하고자 하는 대상이 생겼을 때마다 매번 대조 개체와 비교 개체 사이에 혼성화 실험을 1대 1로 새로 해야 하는 불편함이 있으며, 또한 실험이 까다롭고 비용과 노력이 많이 드는 단점이 있다. 그래서 최근에는 최근에는 유전체의 상동성을 직접 평가할 수 있는 유전체 기반 기술이 등장하여 혼성화 실험을 대체하고 있는 추세이다. 비교하고자 하는 두 개체의 전장 유전체 염기서열을 결정한 후 그 염기서열 유사도를 계산하는 것이다. 전장 유전체 유사도 계산법에는 몇 가지 방법이 있는데, 그 중 ANI(Average Nucleotide Identity)값⁹⁾이 널리 쓰이고 있다.

ANI 계산을 통한 유전체 염기서열 유사도 산출 방법 (출처: 한국미생물학회)

이하나/고려대학교

김승범/충남대학교

1. Schildkraut, CL, Marmur, J, Doty, P (1961) The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies. J Mol Biol. 3: 595-617.
2. Johnson, JL. (1981). Genetic characterization. In Manual of Methods for General Microbiology (P Gerhardt, RGE Murray, RN Costilow, EW Nester, WA Wood, NR Krieg, GB Philips, eds), pp. 450-472. ASM Press, Washington, DC.
3. Jahnke, KD. (1994) A modified method of quantitative colorimetric DNA-DNA hybridization on membrane filters for bacterial identification. J Microbiol Meth. 20: 237-288.
4. Ezaki T. et al. (1989) 'Fluorometric Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative to Membrane-Filter Hybridization in Which Radioisotopes Are Used to Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains'. Int J Syst Bacteriol 39: 224-229.
5. Mehlen, A, Goeldner, M, Ried, S, Stindl, S, Ludwig, W, Schleifer, KH. (2004) Development of a fast DNA-DNA hybridization method based on melting profiles in microplates. Syst Appl Microbiol. 27: 689-695
6. De Ley J. et al. (1970) 'The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates'. European Journal of Biochemistry/FEBS 12: 133-142.
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