플라스미드 정제 실험에서요

 순서대로 설명합니다.

 

RNase로 resuspend

RNase로 resuspend가 아니고 RNase가 첨가된 액으로 rsuspend입니다.

플라스미드 분리시 제일 많이 나오는 것이 RNA고요..

이 RNA 가 양이 너무 많아 전기영동시 작은 band들을 가리거나 DNA 정량을 방해합니다.

따라서 이것을 제거해야하며 RNase라는 효소를 이용합니다.

RNase는 다른 효소와는 달리 금속이온같은 cofactor가 필요없고요 상온 뿐만 아니라 끓여도 제 기능을 잃지 않는 독특한 성질을 가지고 있습니다.

따라서 이때 RNase를 첨가시켜주면 다음 단계에까지 계속 남아서 RNA를 제거해 줍니다

 

 SDS로 lysis

boiling 방법을 쓰는 플라스미드 prep인지 alkaline lysis인지 확실히 모르겠으나

어느 방법이든 lysis란 세포막을 녹여서 내용물을 쏟아 내는 단계입니다.

즉, 박테리아 세포막을 부수고 플라스미드를 용액으로 나오게하는 과정입니다,.

 

중화는 NaOH등으로 lysis를 하였을 때 pH가 너무 올라가니 다음 단계에서 내려주려고 처리하는 것입니다,

세포막은 SDS로 녹일 수도 있고 NaOH로도 녹입니다.

SDS는 일종의 계면활성제로 비누같은 역할을 하며 세포막(지질로 구성)을 녹여내고요...

NaOH로 녹이는 경우 맑은 물처럼 되고요

이때 플라스미드 DNA도 해리가 되어 수소결합이 벌어지게 됩니다,

이것을 DNA denaturation이 되었다고 하고요..

따라서  일단 세포막이 녹으면 DNA가 빠져나왔으니 중화 시켜서 벌어진 DNA를 서로 달라붙게 복구시키는 작용을 합니다. 물론 chromosome DNA는 크기가 너무 커서 이런 복구반응이 불가능하고요..

그러나 플라스미드는 두개의 strand가 서로 꼬여있어서 풀어지더라도 도망가지 못하고 있다가 다시 renaturation 되지요..

중화의 목적은 이것이지요..

 

원심분리는 플라스미드 분리중에 여러번 하게 되어 있는데

최종 원심분리단계를 질문하신 것으로 알고 답을 드린다면..

침전물은 대부분이 플라스미드 DNA이고요..

비록 RNase를 처리했어도 약간의 RNA가 남아있겠고요..

단백질이 어느 정도 있을 것으로 추정됩니다만

다른 반응을 방해할 수준은 아니라고 생각됩니다.

 

아..그리고 컬럼은 안에 기질이 들어있는데 대부분 DNA 분리칼럼은 + 이온으로 되어 있어서요..

DNA가 - 이온으로 되어 있어서 이를 달라붙게 하는 거구요..

일단 달라붙은 다음에는 물을 통과시키면 이 결합이 떨어져서 컬럼에서 DNA를 분리시킬 수 있어서 정제가 됩니다.,