일단 gene silencing방법들의 종류는 매우다양합니다.
Transcriptional Gene Silencing:
Post-transcriptional Gene Silencing:
Meiotic gene silencing:
Cellular components of gene silencing:
이렇게 여러단계 전사 번역 단계 번역후단계등 여러단계에서 유전자를 낙아웃 시킬수있는데 이중에서 가장 핵심이 되는 method들을 정리해보겠습니다.
| Antisense 방법 |
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Pathway for Gene Silencing by RNase H-Active Antisense Oligonucleotides
Antisense mediated cleavage of the targeted message by RNase H.
Antisense oligonucleotides은 gene expression(PS) modification입니다. Phosphorothioates에 있는 sulfur atom 이 oligo의phosphate backbonere 의 non-bridging oxygen을 대신하게 됩니다. 저희 주문시스템에서는 * 가 phosphorothioate internucleoside linkage를 나타내게 됩니다. PS oligos는 unmodified phosphodiester (PO) oligos보다 훨씬 큰 non-specific protein binding 경향을 나타내므로 높은 농도로 존재할 경우 독성이나 기타 부작용을 유발할 수도 있습니다. 이러한 문제점은 chimeric designs을 이용함으로 줄이거나 제거될 수 있습니다. 전형적인 phosphorothioate/phosphodiester chimera 는 5'- 과 3'-ends 양쪽에 1개에서 4개의 PS-modified internucleoside linkages 를 갖고 가운데 부분은 unmodified DNA로 구성되는 것입니다.
2'-O-Methyl RNA and 5-Methyl dC
최근에 chimeric antisense oligo design은 2'-O-Methyl RNA bases와 dC를 Methyl-dC로 대신(특히 CpG motif에)하는 경우가 많습니다. 2'-O-Methyl RNA는 nuclease stability와 target mRNA에 대한 antisense oligo의 affinity (Tm) 를 증가시켜줍니다. 그러나 2'-O-Methyl RNA bases는 RNase H cleavage를 유발하지는 않습니다. 그래서 DNA의 RNase H activating domain를 그대로 갖고 있으면서 2'-O-modified RNA를 삽입한 chimeric antisense가 선호되고 있습니다. 5-Methyl dC에 의한 dC의 치환은 antisense oligo의 Tm값을 약간 올려줍니다. CpG motifs 에서 5-Methyl dC의 사용은 또한 in vivo 에서 adverse immune responses를 줄일 수 있습니다. IDT 모든 antisense oligos에 대한 HPLC 정제를 추천하며 세포나 살아있는 동물에 사용하기 전에 정제시 사용된 salt를 확실히 제거하기 위해서 Na+ salt exchange를 할 것을 추천합니다.
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2.RNAi
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small interfering RNA(siRNA)
Genome project 가 완성됨에 따라 유전자지도가 발표되면서 바이오 기술은 더욱 눈부시게 발전 하고 있고 많은 기술들이 도입되어 지고 있다. 근래에 들어 이러한 업적 중 가장 큰 성과로 인정 받은 기술중의 하나가 siRNA(small interfering RNA)이다. 세계적인 과학학술지로 꼽히는 사이언스가 뽑은 2002년 최대의 기술이기도 하며 앞으로 많은 발전이 기대 되어 지고 있는 분야로서 벌써 많은 논문 들이 쏟아져 나오고 있다.
DNA에서 RNA로, 다시 Protein으로 이어지는 Central dogma에서 많은 연구자 들은 RNA 의 존재를 깊이 생각 하지 않았고, 단순한 전달자로 기억 하는 사람들이 많았다,
그러나 small RNA 가 등장하여 유전자 발현에 관여 한다는 것이 밝혀지면서 RNA는 새로운 관심의 대상으로 등장하게 된 것이다.
사실, 인간게놈 지도가 발표됐을 때 인간의 유전자 수가 하등생물과 비교 했을 때 그리 많은 수의 유전자가 아닌것에 의문이 제기 되었고, 이러한 의문에 대한 대답을 유전자의 발현 조절에서 찾아야 한다는 전문가들의 의견이 있었는데, small RNA는 이러한 가설을 뒷바침 해 줄 증가가 될 수 있을지도 모른다.
Micro RNA
21-25 Nucleotide 의 극히 작은 RNA로 진핵 생물에서 유전자의 발현을 조절 하는 물질로서 ,처음 알려진 것은 1993년 Victor Ambros의 연구팀이 Caenorhabditis elegans에서 발생시기를 조절하는 일부 유전자를 찾아내었는데 이들 중 let-7과 lin-4는 단백질을 생산하지 않는 작은 RNA 조각(non-coding RNA)이라는 사실을 발견하면서부터이다
miRNA의 기능은 발생시기를 조절하거나 cell proliferation 과 cell death를 조절, 신경세포로의 분화를 조절한다고 알려져 있다.
siRNAs(small interfering RNAs)
siRNA는 이중가닥의 RNA(double-stranded RNA)가 Dicer에 의해 절단되어 생성되는 21-25nt 크기의 작은 RNA조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들의 존재는 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 Massachusetts 의과대학의 Craig Mello 연구팀의 실험을 통해 처음 확인되었는데, 외부의 이중 가닥의 RNA를 선충에게 주입했을 때 상보적인 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합해 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 기능을 확인했고, 이를 계기로 이런 현상을 RNA interference(RNAi)라고 부른다.
Antisense siRNA is somewhat less efficient than the corresponding double-strand siRNA, displaying an ~5-fold higher IC50. The lower specific activity of antisense siRNA compared (Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 9 2401-2407).
RNAi mechanism
RNAi 과정은 크게 dicer enzyme에 의해 long dsRNA를 siRNA(short interfering RNA)로 자르는 과정과 이 잘려진 siRNA가 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합한 후 cell 내의 상보적인 mRNA에 결합하는 과정으로 이루어진다. 이때 siRNA에 의해 mRNA는 절단되어 그 특정유전자의 발현이 감소되게 된다. 이러한 siRNA는 다음과 같은 방법으로 생성할 수 있다.
• In vitro transcription and dicing of ds RNA
• Synthetic siRNA
• Vectors carrying as RNAi cassette
Dicer
긴 ds RNA를 siRNA로 만들기 위해서는 RNaseIII 형의 Dicer 효소가 꼭 필요하다. 지금까지 dsRNA를 잘라서 siRNA를 만드는데 주로 Dicer나 RNase III가 사용되어 왔다. RNase III의 경우 dsRNA를 12~15mer로 잘라주고, Dicer의 경우 21~23mer로 잘라준다. . (Dicer 구조)
RNA helicase domain 과 2개의 RNaseIII domain , dsRNA 결합 모티브로 이루어져 있으며 dsRNA를 21-23 bp 의 siRNA로 분해 시키는데 그 말단에 2개의 nucleotide 가 돌출 되어 있다. 이때 12~15mer에 의한 만들어진 siRNA에 비해 Dicer에 의해 생성된 siRNA(21~23)가 RNAi실험에 더 효과적인 것으로 보고되었다.
RNAi 기술 활용 분야
현재 까지 virus(예 p24), oncogene(예 bcr-abl), tumor suppressor(예 p53), cell-surface receptor(예 CD4) 연구분야에서 RNAi 기술을 이용한 많은 논문들이 발표되었고, target validation, gene function analysis, signaling pathway analysis, RNAi mechanism studies, therapeutics 등의 분야에서 널리 활용되고 있다.
siRNA를 이용하여 원하는 유전자를 선택적으로 억제 시키는 것이 기존의 유전자 억제 시스템 보다 월등하다는 것은 여러 논문을 통해 확인되고있다. siRNA를 사용하여 목표 유전자를 억제 시키기 위해서는 아래의 3가지 단계의 실험과정이 필요하다.
1. siRNA 디자인
원하는 아미노산 서열을 파악하여 , 3'의 19 nucleotide를 target site로 선택하여 GENBANK database에서 BLAST 통해서 분석하여, 다른 유전자와 큰 homology가 있는지 여부를 확인하고, mRNA에서 2차 구조가 적은 부위가 좋고 GC content 40~50% 미만인 것이 좋다. 그러나 이렇게 디자인 한 것이 모두 효과가 있는 것이 아니고 gene에 따라 다르기도 하다. 더 강력한 유전자의 억제를 원한다면 dsRNA를 Dicer를 이용해 만든 siRNA pool을 사용하는 것이 좋다.
2. siRNA의 세포 내로의 도입
이미 만들어진 siRNA를 세포 내로 도입하기 위해서는 transfection의 방법이 중요하다. 기존에 만들어진 transfection reagent는 주로 plasmid 를 대상으로 고안된 것이 많으므로, 주의를 기울여 선택하는 것이 중요하고, 또한 cell 상태등에 대해서도 민감 하므로 최적 조건을 파악하여 세포 내로 도입하는 것이 중요하다. 미리 만들어진 siRNA를 사용 시 위에서 언급했던 delivery상의 문제가 생길 가능성과 지속적으로 발현 될 수 없는 단점이 있어 in-vivo 에서 siRNA를 발현 할 수 있는 vector를 제작 하는 방법을 이용하는 경우가 증가 하고 있다. 일반 적인 vector뿐 아니라 virus에 기초한 vector들로 있으며 현재 많은 연구가 진행 중이다.
3. 유전자 억제정도의 분석.
Northern, RT-PCR, Western 등의 방법으로 목적하는 유전자의 억제 정도를 측장 할 수 있고, 또한 report gene 을 사용하여 측정 할 수도 있다.
3. Transposon
4. Paramutation
