다양한 방법이 있지만 가장 일반적으로 사용하는 두가지 방법만을 알려드리겠습니다.
(전부다 설명은 불가 ㅡ.ㅡ;; 이것 만으로도 책한권 분량이 나옵니다)
일단 기본적인 지식이 있는 분으로 생각을 하고 말씀드리도록 하지요.
예를들어 크기가 1kb인 insert (foreign DNA)를 크기가 3kb 인 vector에 넣었다고 가정해 보도록 합시다.
이때 subcloning을 위해 사용한 제한효소는 Eco RI 이라고 가정해 보도록 하지요.
이들을 ligation시킨뒤 적당한 박테리아 균주를 이용하여 ligated plasmid를 강제로 박테리아 균주에 주입하여 균주를 transformation (형질전환) 시킵니다.
여기서 형질전환이란 용어를 사용한 것은 다음과 같은 이유에서 입니다.
일반적으로 vector의 경우는 subcloning (외부 유전자를 vector에 옮겨 넣는 과정)을 용이하게 하기 위하여 selectable maker로 엠피실린, 가나마이신, 크로람페니콜등의 anti-biotics에 저항성을 부여하게 되는 유전자를 지니고 있습니다.
그러므로 이 특정 vector가 강제 주입된 박테리아의 경우는 기존에는 없던 형질 (즉, 예전에는 anti-biotics에 의해서 죽게 되었는데 지금은 vector때문에 살 수 있게 되었죠)을 새롭게 지니게 된 셈이 되었기 때문에 '형질이 전환되었다' 라고 말할 수 있게 되는 것입니다.
이런 실험을 하는 이유는 특정 DNA를 증폭하고자 하는데 있습니다.
일반적으로 vector의 성질에 따라 달라지지만 보통 박테리아 하나의 세포내에서 강제 주입된 vector는 적게는 하나 많게는 1000 copy이상 복제가 됩니다.
즉 ligation에 의해서 만들어진 하나의 plasmid construct가 단지 one copy만이 세포를 침투하여 들어 갔지만 이 세포를 12-18시간정도 키우게 되면 (20분에 한번 분열합니다) 수억배이상 동일한 DNA를 증폭할 수 있게 되는 것입니다.
이후 이들 DNA를 분리 정제한뒤 subcloning을 위해 사용하였던 제한효소 (restriction enzyme)를 이용하여 (여기서는 Eco RI) 잘라보면 만약 self ligation 된 clone의 경우는 단지 3 kb vector크기만 나오겠으나 insert가 삽입된 clone의 경우는 1kb + 3kb 두개의 다른 크기를 지닌 DNA 단편을 볼 수 있게 되지요.
다른 방법으로는 만약 vector와 insert의 크기가 동일할 경우에는 위의 제한효소 절단법으로는 알 수가 없게 되지요.
이때 쉽게 이용하는 방법이 바로 polymerase chain reaction (PCR) 입니다.
물론 이것도 DNA를 추출한뒤 insert에 특이적인 작은 DNA단편 (oligo, primer)과 열에 강한 저항성을 가지고 있는 DNA 중합효소인 Taq polymerase를 이용하여 삽입된 부위만을 선택적으로 증폭시키게 되면 insert를 가지고 있는 DNA의 경우는 그 insert가 복제되어 나오겠으나 그렇지 않은 경우는 아무것도 증폭이 되질 않지요.
도움이 되었다면 기쁘겠습니다.
만약 추가 질문이 있으시다면 쪽지를 주도록 하세요^^.
