Western blot 단백질 정량시 추출과정

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Western blot 단백질 정량시 추출과정

작성일 2023.11.17댓글 1건
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WB공부하고있는 연구원입니다. 

다름이아니라 단백질 정량시 추출하는과정에서 어려워서 질문드립니다 ㅠ 

제가 추출해야하는 단백질은 (아직 공부중이에요) rat brain인데 

브레인에서도 단백질 종류가 많은거겠죠...?

단백질종류에 따라서 추출할때 넣는 용액이 다 다른건가요??

예를들어 뇌에서 2가지 단백질을 보고싶다 하면 각각 뇌를 딴후에 각 단백질에 맞는

추출과정을 거쳐야 하는건가요? (제 생각)

프로테이즈 인히비터, 포스페이트 인히비터 에 대한 간단한 매커니즘? 설명이 필요합니다 ㅠ 

간단하게만 설명해주셔도 됩니다!!!


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profile_image 익명 작성일 -

단백질의 고유 구조를 보시거나 하는 게 아니면 버퍼는 어지간하면 동일한 것으로 알고 있습니다.

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뇌를 prep하시고 뇌를 간 후 세포를 녹이고 SDS PAGE를 진행 후 웨스턴 블롯을 하시면 되는데

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뇌를 용해 버퍼로 녹이고 SDS PAGE를 진행하시면 되는데,

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[웨스턴 블롯은 조단백질에서도 타겟 단백질을 식별하는 것이기에 크게 상관 없습니다]

​

만약 정제를 하실 거면 당연히 버퍼도 달라져야 합니다.

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저의 경우 재조합 단백질이 3차 구조가 유지되는지 확인하기 위해 SDS PAGE를 진행하고 머컵토에탄올을 넣지 않고 내렸었습니다. 이런 특수한 경우가 아니면 상관 없을 겁니다.

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중요한 건 loading 한 단백질 양과, 항체의 농도. 두 개가 너무 많으면 비특이적으로 검출 됩니다.

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인히비터는 어떤 효소의 저해제 입니다.

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말그대로 세포가 터지면 당연히 단백질 분해효소 및 다양한 효소가 나옵니다. (평상 시에는 세포의 조절 시스템에 의해 조절 되지만 세포 파괴되면 그런 거 없엄)

이게 단백질을 분해하고 인산화시키고 하는 것인데.

단백질분해 저해제와 인산효소 저해제를 치는 이유는 대충 예상되시죠?

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단백질 분해 효소 저해제 (protease inhibitor)의 경우 단백질이 효소에 의해 분해되지 않게 만드는 것이고

인산화 효소 (phosphase inhibitor)는 인산화에 조절을 받는 단백질을 인산화가 되지 않게 만드는 것입니다.

인산화 효소를 억제하는 이유는 웨스턴 블롯의 목적에 따라서 세포 안에서 인산화가 얼마나 되있냐를 확인할 때 인데요.

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예를 들어 어떤 단백질이 활성화가 되면 인산화가 된 상태라고 가정해봅시다.

저희는 바이러스에 감염된 세포와 감염되지 않은 세포에서 이 단백질이 인산화 정도를 확인하려고 합니다.

​

근데 단백질 추출 단계에서 인산화 효소에 의해 단백질이 인산화가 되었다면 옳바른 실험결과를 볼 수 없겠죠?

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이런식으로 목적에 따라 달라지게 됩니다.

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