추가 내공 500 드려요 !!!대장균 인슐린 유전체 편집 실험 설명 좀 해주세...

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대장균에서 유전체 실험을 할 때에는 유전체 편집이라는 용어를 사용하지 않습니다.

유전체 편집이라는 용어는 주로 진핵세포에서

세포가 가지고 있는 genomic DNA의 일정 부분을 수정할때 사용하는 용어입니다.

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대장균에서 인슐린을 생산하는 과정은 대장균이 원래 가지고 있는 genomic DNA는 건들지 않고,

우리가 원하는 인슐린 유전자가 들어 있는 플라스미드 벡터를 대장균 안에 넣어서 대량생산하는 과정입니다.

이때는 주로 유전자 재조합 기술을 사용하게 됩니다.

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대장균은 주로 2개의 strain으로 구분이 됩니다.

strain은 고양이로 치면 종 같은 건데요.

벵갈, 아비시니안, 코숏 이런거에요.

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DNA를 대량생산할때에는 주로 DH5a strain을 사용하구요.

단백질을 대량생산할때에는 주로 BL21 strain을 사용합니다.

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큼직하게 생산 완료까지의 실험과정을 설명하자면,

1) 인슐린 유전자를 가지고 있는 발현벡터 preparation

2) 인슐린 생산 세포주 (BL21 형질전환)

3) 형질전환된 BL21 생산세포주 배양 > 생산

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BL21에서 인슐린 단백질을 대량생산 하기 위해서는 먼저

BL21이라는 단백질 발현용 대장균 안에 인슐린 유전자를 넣어주어야 합니다.

그럴려면 인슐린 유전자가 들어있는 발현벡터 DNA를 확보해야 하는데요.

다시 말하면 인슐린 유전자가 들어있는 유전자 증폭용 DH5a 에서 인슐린 유전자를 preparation해야 합니다.

양에 따라서 DNA를 소량 뽑을 때에는 mini-prep이라고 하구요.

DNA를 많이 뽑을 때에는 MIDI-prep 이라고 합니다.

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prep을 하기 위해서는 먼저 인슐린 유전자가 들어있는 DH5a 대장균을 많이 키워야 합니다.

37도에서 overnight으로 밤새 키워주면 대장균이 많이많이 자랍니다.

왜냐면 대장균은 30분에 한번씩 세포분열을 하면서 두배로 늘어나거든요.

그렇게 밤새 자란 대장균을 모아서 centrifuge를 1000g로 5분정도 돌리게 되면,

인슐린 유전자를 담고 있는 대장균들이 pellet으로 모이게 됩니다.

그럼 윗부분을 버리고 pellet만 모아서 prep을 시작합니다.

prep은 여러가지 방법이 있는데 그 중에서 가장 흔하게 사용되는 것은 알칼린 lysis라고 하는 방법입니다.

먼저 pellet을 resuspension buffer에 넣어주게 됩니다.

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resuspension buffer 에는 RNase와 EDTA가 들어있는데요.

RNase는 RNA를 분해하는 역할을 하고, EDTA는 세포벽을 흐트러뜨리는 역할을 하게 됩니다.

두번째는 lysis buffer를 사용하게 됩니다. 여기에는 주로 SDS, NaOH 가 들어있는데요.

앞선 resuspension 과정에서 흐트러진 세포벽을 SDS를 통해서 완전히 파쇄하게 됩니다.

그 과정에서 SDS에 의하여 단백질들도 변성이 일어나게 됩니다.

대장균은 핵막이 따로 없기 때문에 세포벽이 없어지면 가지고 있는 DNA들이 buffer로 노출되게 됩니다.

이때 NaOH는 DNA들을 denaturation 즉 풀어주는 역할을 합니다.

원래 DNA가 두가닥으로 존재할 수 있도록 도와주는 힘은 수소결합에 의하여 유지가 됩니다.

이때 NaOH처럼 높은 pH 를 가진 용액에 포함된 OH- 이온이 훨씬 더 강한 수소결합력을 가지고 있기 때문에

DNA 두 가닥 사이의 힘이 끊어지고 한 가닥씩 나누어지게 되는 것이죠.

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참고로 박테리아 (대장균)에는 두 종류의 DNA가 있는데요.

하나는 원래 박테리아가 가지고 있는 박테리아의 DNA 즉 genomic DNA가 있고,

다른 하나는 우리가 원하는 인슐린 유전자를 가지고 있는 플라스미드 DNA가 있습니다.

NaOH를 넣게 되면 두 DNA모두 풀리게 되구요.

이 상태에서 세번째 neutralize buffer를 넣게 되면

neutralization buffer 안에 들어있는 acetic acid로 인하여 pH가 다시 중성으로 돌아오게 됩니다.

그러면 용액 안에 들어있는 OH-의 농도도 줄어들면서 DNA 두 가닥 사이의 수소결합은 다시 회복될 수 있는 환경이 만들어집니다.

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근데 위에 그림에 나온 것처럼 박테리아의 genomic DNA는 길고 linear하고 형태도 복잡해서

다시 원래모양으로 수소결합이 유지되기가 굉장히 어렵습니다.

따라서 aggregation이 일어나면서 하얀색으로 침전이 일어나게 됩니다.

반면에 플라스미드 DNA는 크기도 작고 주로 supercoiling이라는 형태로 예쁘게 꼬여 있어서

denaturation 전으로 돌아갈 수 있는 확률이 훨씬 높습니다.

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따라서 세번째 buffer를 넣게 되면 최종적으로 용액 안에 soluble하게 남아 있는 주된 분자는

우리가 원하는 인슐린 유전자를 가지고 있는 플라스미드 DNA가 됩니다.

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이 상태에서 다시 13000g 5분정도 centrifugation을 진행하게 되면

앞서 말씀드렸던 단백질, 박테리아 DNA, 세포벽 등등이 모두 침전되고

반면 플라스미드 DNA는 상등액에 존재하게 됩니다.

조심스레 상등액을 분리하여 실리카 기반으로 만들어진 column에 넣어주게 되면

거기에 플라스미드 DNA가 모두 붙고 나머지는 빠져나가게 되는데요.

이걸 나중에 물로 다시 elution 해주면 우리가 원하는 인슐린 DNA를 얻게 됩니다.

그러면 농도를 간단하게 재서 어느정도 나왔는지 확인을 해주면 됩니다.

여기까지가 1단계.

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2단계는 그렇게 얻어진 DNA를 다시 BL21이라는 발현용 대장균에 형질전환하는 일입니다.

DNA를 얻게되면 그 DNA를 다시 발현용 대장균에 넣어주어야 합니다.

그다음에 아까 위에서 했던 것처럼 대장균을 많이많이 불려서 그 안에서 이번에는

DNA가 아니라 단백질을 분리하는 방법으로 인슐린을 얻게 됩니다.

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DNA를 발현용 대장균에 넣어주기 위해서는

발현용 대장균이 미리 competent cell의 형태로 존재해야 합니다.

competent cell은 말하자면 대장균의 세포벽이 흐슬흐슬해져 있는 형태를 말하는데요.

CaCl2나 MgCl2 RbCl2와 같은 2가 양이온이 포함된 buffer를 이용하여 만들수 있습니다. (보통 사서 씁니다.)

이러한 comp cell은 주로 -80도에 보관하다가 사용하기 직전에 꺼내서 얼음에 박아둔 후 녹으면 사용합니다.

이 상태에서 comp cell과 DNA를 섞어주고, 5분정도 두면 DNA와 대장균이 결합을 하구요.

42도에서 1분정도 shock을 주게 되면 DNA가 대장균 세포 안으로 쏙 들어가게 됩니다.

그것을 미리 만들어둔 LB agar plate에 알맞은 항생제와 함께 뿌려주고

하루밤 키우게 되면 DNA가 들어간 대장균만 살아서 colony 모양으로 자라게 됩니다.

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LB agar plate는 보통 LB 25g과 agar 15g을 1L의 물에 넣고 121도에서 20분 동안 푹 끓인후

dish에 부어서 굳혀서 만듭니다.

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다시 돌아가서 인슐린 DNA가 들어간 BL21 colony는 이제 인슐린을 많이 생산할 준비가 마쳐진 상태입니다.

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위 과정에는 전기영동과정이 필요없습니다.

전기영동은 cloning 과정에서 주로 필요한데 클로닝을 다적기에는 여기가 부족한 것 같아서 스킵

만약에 그 부분이 궁금하시면 다시 물어보세용~