이온 교환 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography, IEC)는 전하 차이를 이용하여 화학종을 분리하는 방법이다. 1958년 무어(S, Moore)와 스타인(W. H. Stein) 등은 닌하이드린(ninhydrin)에 의한 아미노산의 정량과 자동 분석기기를 개발하여 생화학분석에 기여한 공로로 1972년 노벨상을 수상받았는데, 이때의 아미노산 분석은 양이온 크로마토그래피의 과정을 통하여 이루어졌다.  

목차

머무름에 있어 주요 메커니즘은 고정상에 결합한 반대 전하를 가지는 이온과 용액(시료)에 존재하는 이온 용질 사이의 정전기적 인력이다. 고정상 혹은 이온 교환체의 고정된 이온은 양전하를 분리할 때는 "음이온-교환물질"로 음전하를 분리할 때는 "양이온-교환물질(교환체)"을 사용한다. 즉, 고정상에 결합한 하전된 부위와 용질 이온들의 사이의 인력에 의해 시료를 분리하는 것으로 음이온 혹은 양이온 혼합물이 음이온 혹은 양이온 교환 수지(이온교환체)로 충전된 HPLC 칼럼으로 음이온 혹은 양이온 혼합물을 분리하는 방법이다. 분리된 이온들은 전도도 검출법을 주로 사용하였으나 최근에는 다양한 분광 광도법 및 전기화학적 검출기 등도 사용한다.  

IEC의 전문화된 형태가 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC)이며, 무기 양이온, 음이온, 저 분자량 화학종, 수용성 유기산, 그리고 염기 등의 분리에 이용한다. 비록 이러한 화학종의 분리에 사용되는 대부분의 HPLC 기술이 이온 교환 크로마토그래피라고 할 수 있지만, 일반적으로 이온 크로마토그래피는 이온-교환 칼럼과 전도도 검출기를 사용하는 경우를 말한다. 따라서 이온 크로마토그래피 그 자체는 이온 교환 크로마토그래피의 하위 방법으로 분류될 수 있다. 억압 IC는 용리액의 반응을 낮추고 용질의 신호를 증가시키기 위해 칼럼과 검출기 사이에 억제기(suppressor)라고 하는 막(멤브레인) 장치를 사용한다. 그러나 비억제 혹은 단일-칼럼 IC에서는 억제기를 사용하지 않는다. 이온 크로마토그래피는 억제 칼럼(suppressor-based column) 방식과 단일칼럼(single-column) 방식 방법이 사용된다. 

이온 용질이 칼럼을 지나가면서 정지상에 결합한 반대 이온(counter-ion)과 교환으로 이동상과 정지상 사이에 분배된다. 용액 안의 전기중립성(electro-neutrality)은 이온-교환 과정 중에는 반드시 유지되어야 하고 그 교환은 화학량론적이다. 즉 하나의 1가 용질은 하나의 1가 반대 이온과 치환된다. 결과적으로 다른 이온 용질의 크기, 전하밀도, 구조 등의 차이에 의해 분리가 이루어진다.

그림 1. 이온 교환 크로마토그래피 (출처: 대한화학회)

교환 반응에 대한 평형 상수는 선택 계수로 알려져 있고 다양한 이온들의 대략적인 용리 순서를 예측하는 데 사용된다. 일반적으로 선택 계수는 용질 이온의 극성 크기가 증가하면 증가한다. 따라서, 높은 전하와 작은 수화물 반경을 갖는 이온은 이온 교환기에 대해 가장 큰 친화성을 가져야 한다. 비록 이것은 사실이지만, 때때로 이온 교환은 머무름의 유일한 메커니즘은 아니다. 예를 들어, 용질들은 이온 교환 매트릭스의 표면에 흡착될 수 있다. 이 경우, 용리 순서를 예측하기 어렵다.

센 산 양이온 교환체와 양이온의 상호작용에 대한 선택 계수는 다음과 같다.

Pu⁴⁺ >> La³⁺ > Ce³⁺ > Pr³⁺ > Eu³⁺ > Y³⁺ > Sc³⁺ > Al³⁺ > Ba²⁺ > Pb²⁺ > Sr²⁺ > Ca²⁺ > Ni²⁺ > Cd²⁺ > Cu²⁺ > Co²⁺ > Zn²⁺ > Mg²⁺ > UO₂²⁺ >> TI⁺ > Ag⁺ > Cs⁺ > Rb⁺ > K⁺ > NH₄⁺ > Na⁺ > H⁺ > Li⁺.

이러한 순서는 만약 이온 교환이 유일한 작동 메커니즘인 경우, 칼륨염을 사용하여 만든 용리액이 소듐 염을 사용한 것보다 더 센 용리액이 되리라는 것을 예측할 수 있다.

유사하게, 센 염기 음이온 교환체에 대한 음이온의 상호작용에 대한 선택 계수 순서는 다음과 같다.

Citrate > salicylate > ClO₄^- > SCN^- > I^- > S₂O₃^2- > WO₄^2- > MO₄^2- > CrO₃^2- > C₂O₄^2- > SO₄^2- > SO₃^2- > HPO₄^2- > NO₃^- > Br^- > NO2^- > CN^- > CI^- > HCO₃^- > H₂PO₄^- > CH₃COO^- > IO₃^- > HCOO^- > BrO₃^- > ClO₃^- > F^- > OH^-. 

이온 교환체는 지지체 유형과 전하를 제공하는 작용기에 따라 다르다. 가끔 일부 무기 물질이 지지체로 사용되고 있으나, 작용기가 있는 실리카와 합성 폴리머 수지가 가장 일반적인 지지체이다. 합성 중합체 수지는 전형적으로 스텔린-다이비닐벤젠 혹은 메카아크릴산-디비닐벤젠 중합체이다.

실리카 지지체의 단점은 높은 pH와 낮은 pH에서 실리카의 불안정성 때문에 일반적으로 pH 8 이상과 2 이하에서 사용할 수 없다는 것이다. 합성 중합체는 보다 폭넓은 pH 범위에서 사용 가능하며 탄수화물 분석의 경우 pH 12 이상에서도 종종 사용된다. 그러나 합성 중합체는 용리액의 조성에 따라 수용성 이동상과 접촉할 때 팽창이 발생할 수 있다. 실리카-기본 칼럼과 중합체 수지 칼럼의 주요 차이점은 이온 교환 용량이다. 이온교환 용량은 수지의 단위 무게당 작용기의 수로 결정한다(건조 수지 g 무게 당 밀리의 전하 mEq). 중합체 수지의 이온 교환 용량은 3-5mEq/g 이며 실리카-기본 칼럼보다 크다.  

이온 교환체로는 스타이렌과 디비닐벤젠의 중합체인 폴리스타이렌 수지가 사용되며 양이온 교환 수지를 만들려면 벤젠고리에 설폰산기(-SO₃)를 붙이고, 음이온 교환수지를 만들려면 양이온 작용기인 암모늄기(-NR₃⁺)를 붙인다. 이온 교환체는 센 산성 또는 약산성, 센 염기성 또는 약염기성으로 분류된다. 

IEC에서 이동상 혹은 용리액은 염 수용액이나 염의 혼합물이며, 종종 적은 양의 유기용매를 첨가한다. 염 혼합물은 완충용액이거나, 필요하다면 완충용액을 가해준다. 용리액의 주성분은 용질이 용출되도록 하는 경쟁 이온(competing ion)이다.    

일반적으로 이동상은 액체이며, 설폰산기와 같은 음이온이나 암모늄기와 같은 양이온이 수지(resin) 고체 정지상에 결합되어 있어 반대 전하의 용질 이온들은 정전기적 인력으로 인해 정지상에 끌린다.