다중클로닝 부위

다중클로닝 부위 (multiple cloning site, MCS)는 클로닝에 사용하는 벡터에 있는 염기 서열이다. 임의의 DNA를 제한효소로 절단한 후 벡터에 클로닝 하기 쉽게 하도록 다중클로닝 부위에 여러 제한 효소의 인식 부위가 들어있다.  

목차

다중클로닝 부위에 있는 제한효소 인식부위는 그 벡터의 다중클로닝 부위에만 있도록 설계되어 있다. 예를 들어 EcoRI이라는 제한효소 인식부위가  다중클로닝 부위에 있다면 그  벡터의 다중클로닝 부위 이외의 지역에 EcoRI이 절단하는 자리가 없다. 이렇게 제한효소 인식부위가 다중클로닝 부위에만 있도록 다중클로닝 부위를 설계해서 DNA 절편을 벡터로 클로닝 하기 쉽도록 한다. 이 다중클로닝 부위는 분자생물학 실험이나 생명공학 실험을 진행하는 데 있어서 매우 중요하다. 

pUC19은 분자생물학에서 널리 사용하는 클로닝 벡터의 하나이다. 이 벡터는 2,686개의 염기 쌍을 갖고 있다. 이 벡터는 조아킴 메싱 (Joachim Messing) 교수의 연구진에 의해 'Gene' 학술지에 1985년 발표된 이후  15,000회 이상 피인용 될 정도로 학계에서 널리 사용되는 벡터이다 (근거: Google Scholar). 이 벡터는 베타-갈락토시다제 (ß-galatosidase, 다른 이름으로는 lacZ)를 갖고 있는데 이 lacZ 염기서열 안에 다중클로닝 부위가 들어있다. 

이 pUC19의 다중클로닝 부위의 염기서열은 다음과 같다.

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

이 pUC19의 다중클로닝 부위는 다음의 제한효소 인식부위를 갖고 있다. 

EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, HindIII

이 제한효소의 인식 부위는 lacZ의 번역의 읽기 틀 (reading frame)에 맞도록 설계되어 있다. 다중클로닝 부위에 아무 DNA가 삽입되지 않으면 lacZ 단백질이 정상적으로 발현한다

lacZ 유전자는 베타-갈락토시다제를 만드는 유전자이다. 이 베타-갈락토시다제는 베타-갈락토시드 (ß-galatoside)를 단당류로 가수분해하는 것을 촉매 하는 효소이다. 따라서 배지에 락토스 (lactose)의 유사체인 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)이 있으면 베타-갈락토시다제는 이 X-gal을 갈락토스 (galactose)와 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole로 분해한다. 이 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole는 자발적으로 이합체 (dimer)를 만든 후  5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo로 산화된다. 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo는 비수용성이며 진한 청색을 띠기 때문에 육안으로 쉽게 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo의 형성 여부를 관찰할 수 있다. lacZ 유전자가 정상적으로 발현하면 X-gal을 분해하여 진한 청색이 나타난다. 만약 DNA를 다중클로닝 부위에 삽입하면 lacZ의 번역의 읽기 틀이 망가진다. lacZ 유전자가 정상적으로 발현하지 못하기 때문에 X-gal을 분해하지 못하고 흰색이 나타난다. 

청색과 백색이 나오는 여부로 다중클로닝 부위에 DNA가 삽입되었는지 아닌지를 판단할 수 있다. 

그림 1. pUC19 벡터의 지도와 다중클로닝 부위 (MCS)의 염기서열 ()

pBluescript II는 일반적인 클로닝 용도 외에 박테리오파지에도 사용할 수 있는 벡터이다. 이 pBluescript II의 다중클로닝 부위의 염기서열은 다음과 같다.

GGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC

이 pBluescript II의 다중클로닝 부위는 다음의 제한효소 인식부위를 갖고 있다. 

KpnI, ApaI, XhoI, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, EagI, BstXI, SacII, SacI

이 제한효소의 인식 부위는 lacZ의 번역의 읽기 틀에 맞도록 설계되어 있으며 lacZ 단백질의  읽기 틀의 방향에 따라 두 종류의 벡터 (pBluescript II SK와 pBluescript II KS)가 있다. pBluescript II SK는 다중클로닝 부위가 lacZ 단백질의  읽기 틀 내에서 SacI부터 시작해서 KpnI으로 끝난다. 반면 pBluescript II KS는 다중클로닝 부위가 lacZ 단백질의  읽기 틀 내에서 KpnI에서 시작해서 SacI으로 끝난다. 

그림 2. pBluescript II KS 벡터에 존재하는 다중클로닝 부위 (MCS)의 염기서열 ()

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres (2008) Genetics: from genes to genomes. 3rd edition. McGraw-Hill 

Yanisch-Perron, C.; Vieira, J.; Messing, J. (1985). 'Improved M13 phage cloning vectors and host strains: Nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors'. Gene. 33 (1): 103–119. 

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